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目的:本实验室前期的研究发现在SLE患者和RA患者血清中mi R-34a表达水平上调,同时证实IL-6/TNF-α可通过NF-κB-mi R-34a信号轴调节Th17和调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的平衡。本研究采用体外转染mi R-34a的模拟物和抑制剂以及NF-κB抑制剂对NF-κB-mi R-34a信号轴进行干预,进一步验证NF-κB、mi R-34a、Foxp3(Treg细胞的关键转录因子)这三者之间的关系。应用DBA小鼠建立胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,给予mi R-34a模拟物和抑制物处理,观察mi R-34a对CIA模型鼠的病程影响,及其对局部Treg/Th17的调节作用。利用mi R-34a转基因小鼠(mi R-34a TG)建立CIA模型,进一步验证mi R-34a对CIA进程和Treg/Th17平衡的影响。方法:(1)小鼠T淋巴瘤细胞系EL-4细胞于体外分别转染mi R-34a模拟物(agomi R-34a)和mi R-34a抑制物(antagomi R-34a)36 h,将转染agomi R-34a的EL-4细胞与转化生长因子β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)共培养12 h,转染antagomi R-34a的EL-4细胞与TGF-β、IL-6及TNF-α共培养12 h,利用Immunoblot技术检测Foxp3的蛋白表达水平。(2)免疫磁珠法分选出小鼠脾脏的初始CD4+T细胞(Na?ve CD4+T cells),在诱导i Treg的细胞因子条件下,分别加入IL-6、TNF-α和NF-κB抑制剂(BAY11-7082)培养24 h,利用q PCR技术检测mi R-34a的表达水平,通过Immunoblot技术检测Foxp3的蛋白表达水平。(3)建立DBA小鼠的胶原诱导性关节炎模型,分别于初次免疫后的第28 d、31 d、34 d、37 d和40 d尾静脉注射200μL的agomi R-34a(10 n M)、antagomi R-34a(60 n M)以及对照试剂,观察小鼠的发病情况(小鼠一般情况、临床评分、病理学检查和影像学检查)。利用流式细胞术检测小鼠脾脏及引流淋巴结的Treg/Th17细胞比例情况。(4)建立C57BL/6背景的mi R-34a转基因小鼠的胶原诱导性关节炎模型,将其与正常的野生型C57BL/6进行对比,检测体内各项指标(同(3)),对比两种小鼠对CIA诱导的易感性。结果:(1)Immunoblot结果显示在TGF-β诱导的Foxp3+EL4细胞中,mi R-34a模拟物能够下调Foxp3的蛋白表达水平。而mi R-34a抑制物能够上调EL-4细胞中的Foxp3蛋白水平。(2)将初始CD4+T细胞诱导为i Treg的过程中,加入的IL-6和TNF-α能够上调mi R-34a的表达水平,下调Foxp3的表达水平。当使用NF-κB抑制剂阻断其信号通路时,则部分逆转了IL-6/TNF-α对Foxp3的抑制作用,mi R-34a的表达水平明显降低。(3)成功应用DBA小鼠建立CIA模型。空白对照组小鼠未发病,诱导的小鼠在23 d左右发病。agomi R-34a组在第二次注射后炎症程度明显加重,临床评分呈持续上升趋势,最高达11分。antagomi R-34a组的临床评分呈明显的下降趋势,平均在3-4分。影像学和病理学检测与临床得分一致,即CIA-agomi R-34a组的疾病严重程度高于CIA组,注射antagomi R-34a后能够有效缓解关节炎症。流式细胞术分析结果显示CIA的发病严重程度与Treg/Th17的失衡呈正相关,注射了antagomi R-34a后能够部分逆转Treg/Th17的失衡。(4)采用C57BL/6背景的mi R-34a转基因小鼠成功建立CIA模型。两组小鼠的发病时间都在初次免疫后的24 d左右发病。CIA-C57组小鼠的临床评分约为6分。CIA-mi R-34a TG组小鼠的临床临床评分高达10分。病理学,影像学等检测结果与上述CIA-agomi R-34a组的趋势一致。结论:确定了IL-6/TNF-α可以通过NF-κB-mi R-34a信号通路调节Treg细胞的分化发育。在CIA模型中,mi R-34a能够通过加剧Treg/Th17的失衡,从而加重关节炎的严重程度,这一结果在mi R-34a转基因鼠的CIA模型中也得到了证实。mi R-34a抑制物能够部分逆转Treg/Th17的失衡,从而减轻CIA的病情。