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以转CpTI基因苹果（Malus domestica Borkh）组培苗（包括红富士、乔纳金、王林和皇家嘎拉等60个株系）为试材,对苹果组培苗中的外源CpTI基因进行了反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测技术研究。采用的技术流程为:通过提取苹果组培苗中总RNA获得CpTI的RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增获得CpTI的特征片段。本研究对RNA提取方法进行了研究,比较了目前常用的几种提取植物组织中总RNA的方法,建立了RT-PCR检测技术体系。主要研究结果如下: 1.酚类化合物、多糖、蛋白质和次级代谢产物是影响从苹果组织中提取总RNA的几个主要干扰因素。试验比较和改进了RNAplant试剂盒法、CTAB-异硫氰酸胍法、改良CTAB法、尿素法和热硼酸法等五种常用的植物组织总RNA提取方法。通过对RNA的质量、提取效率、提取时间以及试剂费用等多方面进行比较,提出改良CTAB法为从苹果组培苗中提取总RNA的最佳方法。该方法的提取缓冲液包括2%CTAB,2.0mol/L NaCl,100mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）,20 mmol/LEDTA（pH 8.0）,2%β-巯基乙醇（使用前加入）。该方法有效地去除了酚类化合物、多糖、蛋白质等污染,在3小时之内可得到高纯度、完整的、适宜进行RT-PCR操作的RNA模板,从而保证了检测的成功。 2.利用DNase I去除RNA中的DNA后,采用M-MLV反转录酶,建立了适合苹果组培苗的反转录体系,合成的cDNA片段在100～1500bp之间,可满足对cDNA分析的要求。 3.依据CpTI基因序列设计合成特异引物,采用RT-PCR的方法扩增出了309bp的PCR产物,与预期目的片段长度一致。 4.适合苹果组培苗RT-PCR分析体系为:在反转录体系中,引物使用浓度为0.8μmol/L,RNA模板的用量为1.0 μg;PCR选用25 μL体系,引物浓度为0.6 μmol/L,Mg2+浓度为1.6 mmol/L,dNTPs浓度为300 μmol/L,Taq酶用量为1.5U;PCR扩增程序为:94℃,2mins;94℃,50s,55℃,50s,72℃,100s;30循环;72℃,10mins;4℃保温。 5.对外源CpTI在60个株系苹果组培苗中的表达进行RT-PCR检测,结果如下:54和60号2个株系没有得到目的片段,42～50、52、55～59等15个株系得到的目的片段亮度暗,其余43个株系得到的目的片段明亮。