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目的:糖尿病属内分泌代谢疾病,近来其发病率呈上升趋势,其中1型糖尿病患病率以每年2%-3%的速度增长。高糖诱导胰岛β细胞凋亡是糖尿病发病的重要病理基础之一。余甘子是一种治疗糖尿病的传统藏药,课题组前期实验结果表明,余甘子中的有效成分没食子酸可能对抑制胰岛β细胞凋亡有一定作用。本实验拟建立高糖诱导胰岛β细胞凋亡的体内、体外模型,深入研究没食子酸对抗胰岛β细胞凋亡的作用及其机制,以期为余甘子中天然活性产物没食子酸的后续研究、开发及中药天然活性产物治疗1型糖尿病的研究提供实验依据。方法:1.RP-HPLC法测定藏药余甘子醇提物中主要成分没食子酸的含量采用Agilent C18 ZORBAX SB-C18柱(4.6×250 mm,5um);流动相:甲醇-0.2%磷酸(5:95);检测波长:273nm;柱温:25℃;流速:1mL/min的色谱条件进行含量测定。2余甘子中没食子酸对糖尿病模型大鼠的影响糖尿病大鼠模型的建立:70只Wistar雄性大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ,50mg/kg),3d后尾静脉采血测随机血糖。分组给药:大鼠按随机分组法分为正常组、模型组、阳性组(西格列汀,10.5 mg/kg)、没食子酸高、中和低剂量组(80、40、20 mg/kg),连续灌胃6周,6周后腹主动脉取血6mL并解剖摘取胰腺。酶联免疫吸附法(Elisa)测定血清和尿液胰岛素含量。大鼠胰腺组织进行HE染色。大鼠胰腺组织进行醛品红-橙黄G染色。Western Blot Blot法检测大鼠胰腺组织中TRX、TXNIP、Caspase-1、NLRP3和NF-κB蛋白的表达。RT-PCR法检测大鼠胰腺组织中TRX、TXNIP、Caspase-1、NLRP3和NF-κB mRNA的表达。3.余甘子中没食子酸对高糖环境下胰岛β细胞的影响MTT法测定INS-1细胞生长曲线。高糖模型建立:以大鼠胰岛瘤细胞株INS-1细胞作为体外研究对象,建立高糖诱导细胞凋亡模型,配制含高浓度葡萄糖培养基培养INS-1细胞,为下一步实验确定最优造模条件。采用MTT法测定不同浓度的葡萄糖和没食子酸对INS-1细胞活性的影响。采用流式细胞术检测INS-1细胞凋亡。采用AO/EB双染法观察INS-1细胞凋亡情况。Western Blot法检测INS-1细胞中TRX、TXNIP、Caspase-1、NLRP3和NF-κB蛋白的表达。RT-PCR法检测INS-1细胞中TRX、TXNIP、Caspase-1、NLRP3和NF-κB mRNA的表达。结果:1.余甘子醇提物中没食子酸峰形与基线能较好的分离,峰形良好,在2-22μg/μL(r~2=0.997)内线性良好,平均加样回收率为97.2%,平均含量为1.21mg/g。2.当11.1mmol/L≤随机血糖<30mmol/L时模型成功。Elisa法测定结果显示模型组血清胰岛素含量较正常组大鼠降低,尿液中的胰岛素含量增加,差异有统计学意义(p<0.05);没食子酸可增加血清中的胰岛素含量,降低尿液中的胰岛素含量,差异有统计学意义(p<0.05和p<0.01)。HE染色结果显示:正常组大鼠胰腺组织细胞边界整齐,细胞聚集分布,含丰富的细胞浆;模型组大鼠胰岛细胞边缘不齐,分布散乱,细胞数量和细胞浆明显减少。给予没食子酸后胰岛细胞形态有明显变化。醛品红-橙黄G染色结果显示:正常组大鼠胰岛β细胞细胞形态完整,细胞质呈深紫色,细胞内微粒含量丰富。给予没食子酸后胰岛β细胞形态学有较明显改善。Western Blot结果显示,没食子酸可下调糖尿病模型大鼠胰腺组织中TXNIP、NLRP3、NF-κB、Caspase-1蛋白表达水平,上调TRX的表达,差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05)。RT-PCR结果显示,没食子酸可下调TXNIP、NLRP3、NF-κB和Caspase-1 mRN A表达水平,上调TRX mRNA的表达,差异有统计学意义(p<0.01和p<0.05)。3.根据细胞生长曲线筛选出细胞最佳接种密度为25000个/孔。与对照组比较,INS-1细胞在葡萄糖浓度为25mmol/L的培养基中培养48h后,细胞存活率明显降低,表明高糖诱导细胞凋亡模型建立成功。没食子酸(10、5、2.5μmol/L)对正常细胞影响差异无统计学意义(p>0.05)。没食子酸提升高糖诱导细胞凋亡的存活率,差异有统计学意义(p<0.01)。AO/EB双染结果显示,没食子酸对INS-1细胞凋亡有一定抑制作用。Western Blot结果显示:没食子酸可下调INS-1细胞中TXNIP、NLRP3、NF-κB和Caspase-1蛋白表达水平,上调TRX的表达,有统计学差异(p<0.01和p<0.05)。RT-PCR结果显示,没食子酸可下调TXNIP、NLRP3、NF-κB和Caspase-1 mRNA表达水平,上调TRX mRNA的表达,差异有统计学意义(p<0.01和p<0.05)。结论:余甘子中的没食子酸平均含量为1.21mg/g,没食子酸对STZ诱导大鼠胰岛细胞凋亡和高浓度葡萄糖诱导INS-1细胞凋亡有一定作用,使炎性因子表达降低,从而抑制胰岛β细胞凋亡,其机制与减轻促炎因子NF-κB,NLRP3,Caspase-1,抑制TXNIP与TRX结合有关。