2型糖尿病（T2DM）是一种严重危害人类健康的代谢性疾病,胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损是T2DM发病的中心环节[1]。胰岛β细胞是机体胰岛素的唯一内分泌细胞,其数量、体积及功能状态决定了胰岛素的分泌水平,对维持血糖恒定起重要作用[1]。胰岛β细胞数量的维持主要取决于β细胞新生、增殖、肥大及凋亡之间的动态平衡。T2DM患者,β细胞数量显著低于非糖尿病者,最终导致胰岛素分泌量不足,其机体能量代谢障碍,但其发生机制尚未完全阐明[2-5]。FOXO1是调节细胞氧化应激反应及增殖、凋亡的重要转录因子,广泛表达于糖、脂代谢的重要器官,如肝脏、脂肪和骨骼肌等[6-7]。最近研究显示FOXO1亦表达在成人胰岛中,Guerra等[8]从13例人的组织标本中报道,2型糖尿病人的胰岛中FOXO1的mRNA表达量显著高于非糖尿病对照组,提示高表达FOXO1可能造成β细胞功能损伤。然而,对FOXO1在成熟β细胞中的作用尚不清楚。为此,本研究采用免疫组化方法结合激光共聚焦技术观察FOXO1在胰岛的表达及细胞定位;通过病毒介导的基因转移技术和siRNA干预技术,在培养的大鼠胰腺癌β细胞系（INS-1E）中特异高表达组成性活性的FOXO1（FOXO1-AAA）或抑制其表达水平,观察FOXO1表达水平的改变对β细胞增殖、凋亡的影响;进一步采用基因芯片技术分析了INS-1E中受FOXO1调控的下游靶基因,并对其功能进行了初步的分析预测。具体的研究工作如下:1.首先观察了FOXO1在成年SD大鼠胰腺中的表达及分布:4-6月成年SD大鼠胰腺进行冰冻切片免疫组化分析,结果显示FOXO1特异性表达在胰腺的胰岛组织中。为了进一步确定FOXO1在胰岛组织中的细胞定位,采用免疫荧光标记观察不同荧光标记的FOXO1（绿色）和胰岛素（红色）在胰岛中的分布,激光共聚焦观察发现绝大多数FOXO1蛋白与胰岛素的定位一致（橙色）,表明FOXO1在生理情况下主要高表达在分泌胰岛素的β细胞中。2.为了阐明FOXO1在成熟胰岛β细胞中的作用,我们首先构建了高表达FOXO1的腺病毒载体:利用基因同源重组原理,通过复制缺陷型pAdEasy腺病毒系统构建了磷酸化位点突变的具有组成活性的全长FOXO1（T24AS256AS319A）重组腺病毒,纯化后病毒滴度约为5×10¹²U/ml。病毒感染肝癌细胞系HepG2,通过观察GFP荧光、Western blot等方法证明Ad-FOXO1-AAA重组腺病毒能有效的介导FOXO1蛋白的表达,经灰度扫描及定量分析发现使FOXO1蛋白表达水平升高9.8倍。3.为了比较内源性FOXO1蛋白表达水平降低对成熟β细胞功能的影响,我们构建了针对FOXO1的siRNA腺病毒载体:利用www.ambion.com网站在线设计,并辅助设计软件,选择了三个针对FOXO1的siRNA位点,分别为si-FOXO1-1、si-FOXO1-2和si-FOXO1-3;一个针对FOXO1和FOXO3同源序列的siRNA位点,命名为si-FOXO-pan;以及一个不针对任何基因的随机序列作为阴性对照。人工合成si-FOXO1s的cDNA序列,退火形成的双链cDNA克隆到腺病毒表达载体pAdTrack-CMV上,经PmeI线性化后与pAdEasy-1细胞内同源重组,最后在HEK293细胞中包装为重组腺病毒,分别命名为Ad-si-FOXO1-1、Ad-si-FOXO1-2、Ad-si-FOXO1-3、Ad-si-FOXO-pan和Ad-NC。扩增后测定病毒滴度均约为5×10¹²U/ml。重组腺病毒感染肝癌细胞系HepG2,Western blot检测结果显示,重组腺病毒能有效的抑制FOXO1蛋白的表达,经灰度扫描及定量分析发现抑制效果达45-65%,其中si-FOXO1-3的抑制效果最显著,达到65%。4.为了确定FOXO1表达降低是否影响其转录功能,选取了FOXO1的靶基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）,检测si-FOXO1s对其启动子转录活性的影响:提取HepG2基因组DNA,PCR扩增得到PEPCK基因长约592bp的5′侧翼区启动子序列,插入pGL3-Basic荧光素报告质粒中。加入Ad-si-FOXO1s重组腺病毒感染HepG2细胞后,检测si-FOXO1s对PEPCK启动子转录活性的影响,结果显示,与阴性对照si-NC相比,si-FOXO1s显著降低PEPCK启动子的荧光素酶活性,其中Ad-si-FOXO1-1降低40%,Ad-si-FOXO1-2降低55%,Ad-si-FOXO1-3降低67%,Ad-si-FOXO-pan降低68%,表明构建的Ad-si-FOXO1s能显著抑制FOXO1靶基因的表达,具有功能活性。si-FOXO1-3抑制蛋白表达最低,抑制后FOXO1的功能活性也最低,所以后续实验均选择si-FOXO1-3。5.为了观察FOXO1表达水平的改变对胰岛β细胞功能的影响,首先检测si-FOXO1和FOXO1-AAA重组腺病毒能否有效的下调或上调胰腺癌β细胞系中FOXO1表达水平:将Ad-si-NC、Ad-si-FOXO1-3和Ad-FOXO1-AAA腺病毒感染胰腺癌β细胞系INS-1E,发现有明显绿色荧光表达,进一步采用Western Blot分析各组细胞中FOXO1蛋白质的表达水平,经扫描及定量分析发现Ad-si-FOXO1对FOXO1的表达抑制达74%,FOXO1-AAA导入细胞内使FOXO1表达升高8.7倍。6.采用3H-TdR掺入实验观察FOXO1表达水平的改变对胰岛β细胞增殖的影响,结果显示,降低FOXO1的表达显著促进了β细胞的增殖,而高表达FOXO1则显著抑制了β细胞的增殖;与之相应,MTT检测结果显示,降低FOXO1的表达对β细胞存活有显著促进作用,高表达FOXO1对β细胞存活有显著抑制作用;进一步采用流式细胞仪检测细胞凋亡,结果显示降低FOXO1的表达使β细胞凋亡率降低,反之高表达FOXO1使β细胞凋亡率增加。采用放射免疫法检测感染重组腺病毒后INS-1E细胞胰岛素的分泌情况,实验结果显示,FOXO1表达水平的改变对胰腺癌β细胞系INS-1E的胰岛素分泌没有显著影响。7.为了深入揭示FOXO1在胰岛β细胞中的作用机制,我们进一步采用基因芯片技术研究受FOXO1调节的下游靶基因表达变化情况:提取Ad-si-NC和Ad-FOXO1-AAA重组腺病毒感染的胰腺癌β细胞系INS-1E的总RNA,纯化后制成cDNA探针,与Agilent大鼠全基因组芯片杂交,经过信号检测、微阵列图像分析、计算机软件数据处理,将所得的数据进行比较,筛选出差异表达基因。结果显示,INS-1E细胞中高表达FOXO1与对照组有显著差异（基因表达水平差异>2为显著升高,<0.5为显著降低）的基因254条,其中表达序列标签（expressed sequence taq,EST）有107条,全长基因有147个。表达上调的基因有135个,表达下调的基因有12个。分析其功能后,从差异表达基因中初步筛选出参与调节细胞增殖、凋亡的基因16个。本研究显示在SD大鼠的胰岛中,FOXO1主要高表达在分泌胰岛素的胰岛β细胞中;在培养的胰腺癌β细胞中初步证实,FOXO1转录因子表达水平的变化对分化成熟的β细胞的增殖及凋亡具有调节作用,高表达FOXO1显著抑制了β细胞的增殖,同时使β细胞凋亡率增加,对胰岛β细胞分泌胰岛素的能力没有显著影响;通过基因芯片初步筛选出了受FOXO1调控的与细胞增殖和凋亡相关的基因。这些结果为深入揭示FOXO1调节β细胞的增殖及凋亡的分子机制奠定了基础,为揭示2型糖尿病发生发展中β细胞代偿性增生受损的发生机制提供了重要的线索。