目的：脊髓是躯体感觉信息传入和整合的初级中枢。近年研究表明，脊髓后角小胶质细胞在病理性疼痛的产生和维持中发挥重要的作用。研究结果显示，多种伤害性刺激都可以使脊髓后角的小胶质细胞激活，使之释放白介素-1β、肿瘤坏死因子-α等多种细胞因子，对传导病理性疼痛和产生痛觉过敏起到促进作用。给予P2X4受体阻断剂TNP-ATP(2，3-O-(2，4，6-trini-trophenyl)ATP)、米诺环素等抑制小胶质细胞功能的药物，可明显抑制病理性疼痛和痛过敏的产生。这些研究成果表明在病理性疼痛和痛过敏的产生和维持中，脊髓小胶质细胞的活化发挥了重要作用。但脊髓小胶质细胞被伤害性传入信息激活的机制尚不完全清楚。　　 N－甲基－D－天门冬氨酸(N－methyl－D-aspartate，NMDA)是脊髓后角中重要的神经递质，其受体在脊髓后角，包括小胶质细胞上广泛分布。NMDA及其受体系统在向中枢传递外周伤害性信息，诱导痛觉中枢敏感化方面发挥重要作用。蜜蜂毒(beevenom，BV)疼痛模型是研究炎性病理性痛的良好模型。此模型是将蜜蜂毒溶液注入大鼠足底皮下中心部位，导致足底组织发炎红肿，并引起单相自发痛反应，在注射部位还可以产生原发性的痛过敏，持续时间长达数天。我室既往应用免疫印迹分析(westernblotanalysis)技术，初步观察了蜜蜂毒炎性疼痛模型中脊髓后角小胶质细胞的激活、以及NMDA受体在其中所发挥的作用。　　 本实验则应用免疫组化技术，进一步研究蜜蜂毒炎性痛引起的脊髓后角小胶质细胞的激活情况、以及NMDA受体在此过程中的作用，为阐明病理性痛过程中小胶质细胞的激活机制提供进一步的实验依据。　　 1、蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小胶质细胞激活的动态过程　　 方法：雄性Sprague-Dawley大鼠30只，体重230～270g，随机分为6组：sham1h组、sham1d组、蜜蜂毒1h组、蜜蜂毒1d组、蜜蜂毒3d组和蜜蜂毒7d组(每组n=5)。分别将50μl生理盐水或50μl蜜蜂毒溶液(4g·L-1)注入sham组和蜜蜂毒组大鼠右后足底皮下。Sham1h组和蜜蜂毒1h组动物在测定足底注射后60min内的自发痛反应后取材，其它各组于相应时间点测定注射部位的热痛敏和机械痛敏后取材。取材部位为腰5(L5)脊髓节段。将L5脊髓节段经多聚甲醛固定后，常规冰冻切片，应用免疫组化技术，观察脊髓后角OX-42蛋白的表达情况，评价小胶质细胞的激活状态。　　 实验数据用均数±标准差(x-±s)表示。用社会科学统计程序(StatisticalProgramforSocialSciences13.0)对实验数据进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，比较组间差异。有显著差异者用最小显著差法进行两两比较，判断差异显著性的标准为P<0.05。　　 结果：所有蜜蜂毒组大鼠在注射蜜蜂毒后，均产生注射侧单相性的自发痛反应，表现为自发抬足、舔咬足行为，持续时间超过60min。sham组大鼠则无自发痛反应。蜜蜂毒组大鼠注射蜜蜂毒后1d、3d、7d均产生了明显的热痛敏和机械痛敏(P<0.05)，注射后1d为痛觉过敏的高峰，3d、7d逐渐减弱。　　 免疫组化染色显示，与sham组相比，大鼠在注射蜜蜂毒后1h，L5脊髓节段后角小胶质细胞形态和OX-42的表达未见明显变化。在注射蜜蜂毒后1d时，可见小胶质细胞胞体开始变大，细胞突起增粗，OX-42的表达显著升高(P<0.05)。小胶质细胞OX-42的表达和形态变化在注射后3d达到高峰。注射后7d表达依然明显，但较之3d时有所减弱。以上结果表明，脊髓后角小胶质细胞受到蜜蜂毒炎性痛的刺激后明显激活，其动态变化趋势为：1d开始明显，3d达到高峰，7d开始减弱。　　 2、NMDA受体抑制剂MK-801对大鼠蜜蜂毒炎性痛所致脊髓后角小胶质细胞激活的影响　　 方法：雄性Sprague-Dawley大鼠25只，体重230～270g，随机分为以下5组(n=5)：①sham组：大鼠足底注射NS50μl。②蜜蜂毒组：大鼠足底注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。③蜜蜂毒+MK-801组：MK-801溶液10μl(50nmol)注入大鼠椎管内，间隔15min后大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。④蜜蜂毒+NS组：生理盐水10μl注入大鼠椎管内，间隔15min后，大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液50μl(4gL-1)。⑤sham+MK-801组：MK-801溶液10μl(50nmol)注入大鼠椎管内，间隔15min后，大鼠右后足底皮下注射生理盐水50μl。　　 测定所有大鼠足底注射后60min内的自发痛反应，并于注射后3d时测定热痛敏和机械痛敏。之后，深麻醉下灌注后，取腰5(L5)脊髓节段，冰冻切片后，应用免疫组化技术，观察脊髓后角小胶质细胞的激活状态和OX-42蛋白的表达量。上一组实验结果显示，在注射蜜蜂毒后3d，大鼠L5脊髓节段后角小胶质细胞激活状态最明显，所以本组实验选取足底注射后3d的时间点，观察NMDA受体抑制剂MK-801对脊髓后角小胶质细胞激活的影响。　　 实验数据用均数±标准差(x-±s)表示。用社会科学统计程序(StatisticalProgramforSocialSciences13.0)对实验数据进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，比较组间差异。有显著差异者用最小显著差法进行两两比较，判断差异显著性的标准为P<0.05。　　 结果：蜜蜂毒组大鼠在足底注射蜂毒后产生明显的自发痛行为反应，与sham组相比，其痛行为评分明显增高(P<0.05)。而在蜜蜂毒+MK-801组，给予MK-801明显抑制了蜜蜂毒引起的痛行为评分增高(P<0.05)。蜜蜂毒组大鼠的热痛觉潜伏期和机械缩足阈值明显下降(P<0.05)，而在蜜蜂毒+MK-801组，给予MK-801明显抑制了蜜蜂毒引起的热痛觉潜伏期和机械缩足阈值的下降(P<0.05)。　　 免疫组化染色显示，大鼠注射蜜蜂毒后3d，脊髓后角小胶质细胞较sham组明显激活，其OX-42表达显著升高(P<0.05)。椎管内注射MK-801对足底注射蜜蜂毒引起的脊髓后角小胶质细胞的激活有明显抑制作用，表现为与蜜蜂毒组相比，其OX-42的表达明显下降(P<0.05)，小胶质细胞的激活状态明显减轻。椎管内注射MK-801对sham大鼠脊髓后角OX-42的表达和小胶质细胞的激活状态无明显影响。以上结果表明NMDA受体抑制剂MK-801对大鼠小胶质细胞的激活产生了抑制作用。　　 结论：本研究应用免疫组化方法发现，蜜蜂毒引起的炎性痛导致脊髓后角小胶质细胞呈现动态变化；NMDA受体抑制剂MK-801可明显抑制小胶质细胞的活化，并有效抑制了炎性痛和痛过敏的产生。这些结果提示NMDA受体在外周性炎性痛所致脊髓后角小胶质细胞的活化中发挥重要作用。