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研究背景和目的:结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染引起的传染性疾病,WHO在2018年的全球结核病报告中估算全球有1010万结核病新发病例,仍然是世界范围内一个主要的公共健康问题。结核分枝杆菌感染宿主后可诱导复杂的免疫应答及调控过程,阐明宿主对MTB感染后的免疫调控机制是研制治疗性结核病疫苗的前体和关键。许多研究已证明T细胞在控制MTB感染中可发挥着关键作用。Wnt/β-catenin经典信号通路被认为调控个体发育和体内平衡过程,及宿主对微生物病原体的免疫应答的关键信号通路,已被证明其参与结核病的调控过程,包括对MTB感染后巨噬细胞的炎性反应、调亡及坏死的调控作用。为了证明Wnt/β-catenin信号通路对结核病的免疫调控作用和结核菌耐药研究,我们购买β-catenin基因敲除小鼠(B6.129-Ctnnb1tm2Kem/Knw J小鼠),通过饲养繁殖,构建CD4+T细胞的β-catenin基因敲除小鼠,同时设SPF级野生型C57BL/6小鼠作为对照组,进行H37Rv滴鼻感染,感染28天后进行基因、蛋白质、细菌及病理方面的研究。使用肺结核患者的痰MTB临床分离株,测定177株临床分离株的环丝氨酸MIC值,并对Ald、Alr、ddl A基因进行突变位点及基因表达量的分析。方法:1.繁育CD4+T细胞条件性敲除β-catenin基因的小鼠:购买CANNB1基因敲除小鼠的胚胎,孵育获得β-catenin-/-小鼠,将β-catenin-/-与CD4-Cre转基因小鼠杂交,利用Cre-lox P系统的原理,繁育出CD4+T细胞条件性敲除β-catenin基因(CD4-Cre;β-catenin-/-)的小鼠,并对转基因小鼠进行了鉴定。2.将H37Rv菌株滴鼻感染两组小鼠,野生型及和β-catenin-/-基因敲除小鼠,在感染的第28天获得小鼠的肺及脾脏组织。3.取感染小鼠的肺组织和脾组织标本（1）分离组织中的单核细胞,通过流式细胞术检测T细胞的百分比,研究CD4+T细胞条件性敲除β-catenin基因对T细胞增殖的影响。（2）分离组织中的单核细胞,采用流式技术检测细胞因子（TNF-α、IFN-γ）的水平,研究CD4+T细胞条件性敲除β-catenin基因对感染MTB小鼠体内结核抗原特异性Th1型保护性细胞因子表达的影响。（3）抽提组织RNA,通过Real-time PCR检测细胞因子（TNF-α、IFN-γ）及β-catenin下游转录因子TCF-7的RNA表达水平。（4）将肺、脾组织匀浆涂板,培养2-3周后进行CFU计数,检测组织荷菌量,研究β-catenin基因敲除对感染MTB小鼠的肺及脾细菌负荷的改变。（5）将H37Rv感染后小鼠的脾及肺组织标本,进行病理切片染色,观察基因敲除小鼠感染MTB后的肺及脾的病理变化。4.收集肺结核患者的痰MTB临床分离株,采用7H9液体培养基,测定177株临床分离株的环丝氨酸MIC值。5.筛选出对环丝氨酸耐药及敏感的菌株,提取基因组DNA和RNA,并对Ald、Alr、ddl A基因进行突变位点及基因表达量的分析。结果:1.繁育出CD4+T细胞条件性敲除β-catenin基因的小鼠,通过鼠尾抽提基因组DNA,并通过PCR鉴定出CD4+T细胞条件性敲除β-catenin小鼠的基因表型为:ctnnb纯合（-/-）并且CD4-Cre阳性表达,其中ctnnb纯合子的条带大小为300bp,杂合子的条带大小为300bp和223bp,野生型的条带大小为223bp。2.CD4+T细胞条件性敲除β-catenin后导致脾、肺组织CD3+T及CD3+CD4+T细胞百分比减少。3.采用流式细胞术,对H37Rv感染的小鼠肺、脾单细胞进行胞内染色,发现β-catenin-/-感染小鼠表现出肺、脾组织保护性细胞因子的表达量显著低于β-catenin+/+对照组。4.与β-catenin+/+对照组小鼠相比,β-catenin-/-小鼠感染H37Rv后表现出肺组织内的保护性炎症因子及下游的转录因子水平降低,同时伴随肺、脾组织荷菌量均增加。5.病理方面:基因敲除小鼠感染H37Rv后可观察到肺组织病理炎症程度重于野生型小鼠。6.MDR-TB对环丝氨酸的耐药率仅为4.28%,初步将MIC≥32μg/ml的结核分枝杆菌菌株判定为对环丝氨酸耐药。7.Ald、Alr、ddl A基因位点突变在环丝氨酸耐药菌株和敏感菌株中无差异性,环丝氨酸耐药菌株在Alr基因位点处基因表达量明显高于敏感菌株。结论:1.β-catenin在基因敲除小鼠感染MTB的动物实验中证明其可能调控小鼠结核特异性活化CD3+CD4+T细胞的数量。2.β-catenin-/-感染小鼠的动物实验证明β-catenin在结核病的宿主体内可能起着免疫保护效应。3.目前临床的MDR-TB患者对环丝氨酸的耐药率较低,使用环丝氨酸治疗MDR-TB是一种有效的选择。4.Ald、Alr、ddl A基因位点突变与结核分枝杆菌对环丝氨酸耐药无明显相关性,但Alr基因的过表达与MTB环丝氨酸耐药高度相关,可能是其耐药的新机制。