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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是引起肝脏疾病和肝癌的主要病因之一。在HBV编码的4个蛋白中,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)是由HBV-DNA中最短的开放读取框所编码的。HBx蛋白在HBV的感染过程中发挥重要的调节作用。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)在机体防御外来生物感染和自身细胞癌变过程中发挥重要的作用。研究HBx促使肝细胞调节HMGB1及ROS的分子机制,为更好理解乙肝病毒致病机理并改善乙肝患者预后奠定基础,具有十分重要的临床及社会意义。目的HBx蛋白在HBV的感染过程中发挥重要的调节作用。本课题重点研究HBx过表达对人正常肝细胞HMGB1和活性氧的调节作用及在这一过程中核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)的作用。方法我们首先构建swp-n4flag-HBx质粒,并通过双酶切及PCR两种方法进行鉴定,转染293T细胞,包装产生逆转录病毒,继而用其改造人正常肝细胞(LO2),运用Western-blot测定HBx蛋白以确认成功构建HBx过表达的细胞系,并利用ROS激活剂(鱼藤酮)和NF-κB的激活剂(LPS)分别刺激细胞,最后利用Western-blot检测HMGB1蛋白和NF-κB信号蛋白水平的表达,利用DCFH-DA(活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测剂)检测ROS的变化。结果第一章:(1)PCR扩增HBx基因:得到条500bp左右的条带(与理论预测值486bp相符合);(2)HBx基因逆转录病毒质粒的酶切鉴定:可见500bp左右的条带(与理论预测值486bp相符合);(3)重组质粒swp-n4flag-HBx送测序:结果与Genebank报道的HBx序列完全一致,说明swp-n4flag-HBx质粒构建成功;(4)病毒包装质控;胶体金试纸检测,T条带显色,流氏细胞仪对病毒滴度检测,得到swp-HBx-flag的病毒滴度为3×10~7Tu/mL;(5)Western-blot结果表明:与参照组(mock组)相比,HBx过表达组(HBx-over组)中HBx蛋白的表达量显著增加(P<0.05)。第二章:(1)Hbx-over组与mock组相比,其HMGB1蛋白的表达量显著降低(P<0.05);(2)HBx-over组与mock组相比,其荧光强度较弱表明胞内ROS的合成量低;(3)Hbx-over组与mock组相比,在NF-κB及IκB蛋白的表达量相同的情况下(P>0.05),二者的磷酸化水平降低,表明NF-κB信号通路活化程度降低(P<0.05)。第三章:(1)当使用ROS刺激剂鱼藤酮处理细胞时,随着浓度的增加HBx-over组与mock组的荧光强度均增加,表明胞内ROS含量增加,刺激剂已经发挥作用;随后的Western-blot结果发现在鱼藤酮刺激下HMGB1的表达量增多、NF-κB和IκBa的磷酸化水平升高。(2)当使用LPS作为NF-κB的刺激剂处理细胞时,NF-κB和IκBa的磷酸化水平升高,说明LPS刺激有效,同时HMGB1的表达量在HBx过表达细胞或参照细胞中均明显上调;以上两个实验结果均表明NF-κB与HMGB1之间存在相互调节的关系。结论1.本实验成功克隆出HBx基因,并利用HBx慢病毒转导LO2细胞,经多轮嘌呤霉素的筛选和Western blot检测,证明我们成功的构建出HBx过表达细胞株(HBx-over)和参照细胞株(mock)。2.在HBx过表达的LO2细胞系中HMGB1的合成及细胞内ROS的产生较空白对照组显著减少,表明HBx对HMGB1的合成及细胞内ROS的产生起抑制作用。3.HBx的过表达抑制HMGB1的合成及细胞内ROS的产生是通过NF-κB通路的调节作用实现的。