在中国，膀胱癌的发病率占男性泌尿生殖系恶性肿瘤第1位，而术后膀胱内BCG灌注治疗已经成为非肌层浸润性膀胱癌最广泛采用的免疫治疗方案之一。BCG灌注治疗对于膀胱癌的复发起着重要的作用，但大剂量BCG灌注会导致的各种并发症，如高热、血尿、肝炎、及各种系统并发症等，而且需要多次用药，这些弊端限制了BCG灌注治疗在膀胱癌中的应用。因此探寻低毒副作用，且提高肿瘤特异性杀伤能力的BCG，成为膀胱癌治疗目前亟待解决的难题。　　本研究利用合成生物学的方法进行基因克隆以及构建重组质粒和重组型BCG（rBCG）。通过用PRIMER5.0引物设计软件设计引物，并利用PCR法分别扩增膀胱癌肿瘤特异性抗原Survivin、HYAL-1、NY-ESO-1、MAGE3基因片段，以及细胞因子IFN-γ、GM-CSF、IL-2基因片段。将PCR产物纯化后与pUC18-T载体连接，转化感受态，经蓝白斑筛选、双酶切分析、PCR扩增及测序鉴定；同时提取重组质粒，双酶切后亚克隆入pMV306原核表达载体中。该工作为后续构建rBCG打下了基础。　　同时，为了能够在BCG（或结核分枝杆菌）中整合多个基因，实验利用耻垢分枝杆菌（Mycobacteria smegmatis）自身重组系统开发了一套大片段DNA体内重组克隆系统。实验拼接了长约100kb的利福霉素生物合成基因簇。　　此外，研究发现一个跟渗透压防御相关的生物合成基因簇（ectcluster）只分布于生长速度快的分枝杆菌中，在生长速度慢的分枝杆菌（如BCG，结核分枝杆菌等）中不存在。进一步分析，发现ect cluster在大部分的放线菌中都广泛存在。为了鉴定该基因簇的生物功能，实验利用放线菌模式菌株—天蓝色链霉菌，从体内、体外两个方面，证明了该基因簇与菌体的渗透压防御有直接关系，并且其表达与菌体的氮代谢直接相关。目前还不清楚ectcluster是否对BCG生长速率以及致病性有影响，其实验正在进一步进行之中。　　综上所述，本研究对rBCG的构建体系及构建流程进行了测试，开发了一套分枝杆菌体内大片段DNA重组使能技术，并初步研究了与分枝杆菌生长速率存在一定相关性的ect基因簇。