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背景叉头框蛋白F2(forkhead box F2,FOXF2)作为转录因子,在发育和分化的进程中起重要的调控作用。FOXF2在基底样乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)细胞中特异性高表达,通过转录抑制方式抑制BLBC细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和转移;而在Luminal亚型乳腺癌细胞中,FOXF2通过转录激活下游靶基因促进EMT和转移;但是,FOXF2在BLBC和Luminal亚型乳腺癌中均促进细胞增殖。鉴于FOXF2在乳腺癌中表现为亚型特异性的转录调控作用,而转录因子的转录调控功能多依赖于对不同辅转录调控因子的招募以及复杂的转录复合物的形成,辅转录调控因子对转录因子的转录调控功能起着分子开关的决定性作用。转录抑制作用依赖于辅转录抑制复合物的形成,NCOR1常作为转录抑制复合物中的核心组分与转录因子相互作用,进一步招募HDAC3和HDAC1对靶基因启动子区组蛋白进行去乙酰化修饰以抑制或沉默基因表达。转录激活作用依赖于辅转录激活复合物的形成,SRC家族蛋白常作为基础的辅转录激活因子,与转录因子相互作用后进一步招募其他具有修饰酶活性的二级辅转录因子如CBP/p300以激活靶基因的表达。因此,我们推测在不同亚型的乳腺癌细胞中FOXF2招募不同的辅转录调控因子以形成不同的转录激活复合物和转录抑制复合物,进而转录激活或转录抑制不同的靶基因,而对于不同辅转录调控因子的招募介导了FOXF2在乳腺癌中亚型特异性的转录调控机制。目的本研究旨在阐明FOXF2在不同亚型乳腺癌中转录调节功能的抑制或激活机制,为揭示转录因子调控乳腺癌发生发展进程的多效性和复杂性提供理论依据。方法1.在BLBC细胞MDA-MB-231和Luminal亚型乳腺癌细胞MCF-7中分别过表达FOXF2或直接采用MDA-MB-231细胞,通过裂解细胞制备细胞总蛋白,采用免疫共沉淀(co-immunoprecitation,co-IP)方法检测在MDA-MB-231和MCF-7中FOXF2与NCOR1、HDAC3和HDAC1是否存在相互作用;MDA-MB-231中FOXF2与NCOA1是否存在相互作用;在MCF-7中FOXF2与p300是否存在相互作用。2.采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecitation,Ch IP)和二重染色质免疫共沉淀(Re-Ch IP)检测在BLBC细胞MDA-MB-231中FOXF2是否招募NCOR1和HDAC3形成转录抑制复合物,共同结合于下游靶基因的启动子区;检测FOXF2是否招募p300形成转录激活复合物,共同结合下游靶基因启动子区。另外,采用TNFα激活MCF-7中的NF-κB信号通路,检测NCOA1对FOXF2启动子区的结合;采用ChIP-qPCR检测沉默或过表达FOXF2的MDA-MB-231中NCOR1和HDAC3对FOXF2下游靶基因启动子区的结合能力的改变,以及下游靶基因启动子区组蛋白修饰状态的变化。3.在BLBC细胞MDA-MB-231和BT549中分别沉默NCOR1表达、过表达FOXF2、过表达FOXF2同时沉默NCOR1,采用双荧光素酶报告系统检测FOXF2下游靶基因启动子区的转录活性,以确定NCOR1对FOXF2转录抑制下游靶基因启动子区转录活性的介导作用;采用RT-qPCR和Western blot方法检测FOXF2下游靶基因的mRNA和蛋白表达,以确定NCOR1对FOXF2转录抑制下游靶基因表达的介导作用。结果1.Co-IP实验证实,在BLBC细胞MDA-MB-231中FOXF2与NCOR1和HDAC3相互结合形成转录抑制复合物,但与FOXF2与HDAC1无结合;FOXF2与NCOA1无结合,不能形成转录激活复合物。在Luminal亚型乳腺癌细胞MCF-7中,FOXF2与NCOR1、HDAC3、HDAC1均不存在直接相互结合,不能形成转录抑制复合物;但FOXF2与p300结合,可形成转录激活复合物。2.ChIP和Re-ChIP实验证实,在BLBC细胞MDA-MB-231中FOXF2招募NCOR1和HDAC3形成转录抑制复合物,共同结合于下游靶基因的启动子区;在Luminal亚型乳腺癌细胞MCF-7中激活NF-κB信号通路后,NCOA1可结合于FOXF2启动子区。Ch IP-qPCR实验证实,在沉默FOXF2表达的MDA-MB-231中NCOR1和HDAC3对FOXF2下游靶基因启动子区的结合能力减弱,从而FOXF2下游靶基因启动子区染色质的组蛋白乙酰化修饰增加;在过表达FOXF2的MDA-MB-231中NCOR1和HDAC3对FOXF2下游靶基因的启动子区结合能力增强,从而FOXF2下游靶基因启动子区染色质的组蛋白乙酰化水平下降。3.双荧光素酶报告系统检测证实,在BLBC细胞BT549和MDA-MB-231中单独沉默NCOR1后FOXF2下游靶基因启动子转录活性部分增强;单独过表达FOXF2后下游靶基因启动子转录活性显著降低;过表达FOXF2同时沉默NCOR1后FOXF2下游靶基因启动子转录活性得到恢复,即沉默NCOR1可部分恢复过表达FOXF2对其下游靶基因启动子转录活性的抑制作用。结果证实在BLBC细胞中NCOR1介导FOXF2对下游靶基因启动子区的转录抑制作用。4.RT-qPCR和Western blot检测证实,在BLBC细胞MDA-MB-231和BT549中单独沉默NCOR1后FOXF2下游靶基因的mRNA和蛋白表达水平上调;单独过表达FOXF2后下游靶基因mRNA和蛋白表达显著水平下调;过表达FOXF2同时沉默NCOR1后则可逆转过表达FOXF2引起的靶基因mRNA和蛋白表达水平的下调,部分恢复FOXF2下游靶基因的表达。以上结果证实在BLBC细胞中NCOR1介导FOXF2对下游靶基因表达的转录抑制作用。结论1.FOXF2在BLBC细胞中通过招募NCOR1和HDAC3形成转录抑制复合物,共同结合于下游靶基因启动子区,对染色质组蛋白进行去乙酰化修饰,从而抑制靶基因启动子的转录活性,进而抑制靶基因的mRNA和蛋白表达。2.在Luminal亚型乳腺癌细胞中FOXF2通过招募p300形成转录激活复合物。3.在乳腺癌细胞中NCOA1介导NF-κB信号通路转录激活FOXF2表达。