氧化应激会使肉鸡机体活性氧(ROS)水平升高,引起氧化损伤,导致肉鸡生长性能和肉品质下降,危害肉鸡产业的发展。前人在研究氧化问题时,大都以单一应激源刺激机体间接产生ROS为前提。但应激源的性质和处理方法不同,使得氧化损伤确切机制尚不明确。因此采用直接增加机体ROS水平的方法可为探讨氧化损伤机制提供新思路。已有研究证实过氧化氢(H202)是机体内的高活性ROS,几乎可由所有氧化应激源产生,并且研究表明牛磺酸具有抗氧化性。基于此,本研究拟采用腹腔注射H2O2的方法,研究H2O2诱发的高浓度ROS对肉鸡氧化损伤与生长性能、肉品质变化的效应关系;结合细胞培养研究H202诱发的高浓度ROS对肉鸡肝脏和肌肉细胞凋亡与自噬发生变化规律以及核因子kappa B(NF-κB)通路关键因子表达规律的影响与作用机制,并进一步研究牛磺酸的缓解作用。本研究可为肉鸡生产中建立科学缓解氧化应激的管理与营养调控策略提供理论依据。1.腹腔注射过氧化氢对肉鸡生长性能和肉品质的影响及其对肝脏和肌肉氧化损伤作用研究试验一:研究H2O2对肉鸡生长性能和肉品质以及肝脏和肌肉氧化损伤状态的影响。选取320只1日龄健康AA肉鸡,随机分为5个处理:(Ⅰ):对照组(Control),不进行注射;(Ⅱ):生理盐水组(Saline),腹腔注射0.75%的生理盐水(1 mL/kg BW);(Ⅲ):H2O2(0.74)组,腹腔注射 0.74 mmol/kg BW 的 H202溶液;(Ⅳ):H202(1.48)组,腹腔注射 1.48 mmol/kg BW 的 H202 溶液;(V):H202(2.96)组,腹腔注射 2.96 mmol/kg BW的H202溶液,每个处理8个重复,每个重复8只鸡。饲养期为42 d,在饲养期的第16和37 d进行腹腔注射。结果显示:H202(1.48)和H202(2.96)组肉鸡22-42 d和1-42 d阶段的体增重(BWG)显著低于(P<0.05)Control和Saline组,而H202(2.96)组肉鸡22-42 d和1-42 d阶段以及H202(1.48)组1-42 d阶段的料重比(F/G)显著高于(P<0.05)Control和Saline组;H202(2.96)组的肉鸡胸肌和腿肌以及H202(1.48)组的腿肌宰后24小时的pH(pH24 h)显著低于(P<0.05)Control和Saline组,而H202(2.96)组肉鸡胸肌和腿肌的剪切力以及腿肌滴水损失则显著高于(P<0.05)Control和Saline组;21日龄时,与Control和Saline组相比,腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)肝脏相对重量以及血清的总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)活性,血清和肝脏的总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总巯基含量,显著升高了(P<0.05)血清的高级蛋白产物(AOPPs)含量,血清和肝脏的8-羟基脱氧核糖鸟苷酸(8-OHdG)和丙二醛(MDA)含量以及肝脏的羰基含量,而腹腔注射1.48 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)肝脏相对重量以及血清的T-AOC和总巯基含量,血清和肝脏的T-SOD活性,肝脏的GSH-Px的活性,显著升高了(P<0.05)肝脏的MDA含量;21日龄时,与Control和Saline组相比,腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)胸肌和腿肌的T-AOC、T-SOD和GSH-Px的活性以及腿肌总巯基含量,显著升高了(P<0.05)胸肌和腿肌的羰基、8-OHdG、AOPPs和MDA含量,而腹腔注射1.48 mmol/kg BW的H2O2显著降低了腿肌的T-AOC和GSH-Px活性,显著升高了(P<0.05)胸肌的MDA含量。42日龄时,与Control和.Saline组相比,腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)血清的T-AOC和CAT活性,血清和肝脏的T-SOD和GSH-Px活性以及总巯基含量,显著升高了(P<0.05)胰腺器官指数,肝脏的ROS水平以及血清的8-OHdG含量,血清和肝脏的AOPPs、MDA含量和肝脏的羰基含量,而腹腔注射1.48 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)血清的T-AOC和T-SOD活性,显著升高了(P<0.05)肝脏的ROS水平以及血清和肝脏的MDA含量和肝脏羰基含量;42日龄时,与Control和Saline组相比,腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)肌肉的相对重量,胸肌的线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ活性以及膜电位,胸肌和腿肌T-AOC和T-SOD、GSH-Px的活性,总巯基含量,显著升高了(P<0.05)胸肌和腿肌的羰基、8-OHdG、AOPPs和MDA含量,而腹腔注射1.48 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)胸肌的线粒体复合物Ⅲ活性和膜电位,胸肌和腿肌的T-SOD的活性和总巯基含量以及腿肌的GSH-Px活性,显著升高了(P<0.05)胸肌的羰基和8-OHdG含量以及腿肌的MDA含量。此外,H2O2组的胸肌和腿肌ROS水平均显著高于(P<0.05)Control和Saline组;与Control和Saline组相比,H2O2(1.48)和H2O2(2.96)组肝脏组织形态呈现病理状态并且凋亡细胞数量增多。2.腹腔注射过氧化氢诱导的肉鸡肝脏和肌肉氧化损伤机制研究试验二的设计与试验一相同。研究H2O2诱导的肝脏和肌肉细胞凋亡与自噬发生的变化规律和NF-κB信号通路关键因子的表达。结果显示:21日龄时,与Control和Saline组相比,腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)肝脏的核因子kappa B副族1(p50)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)和v-rel禽网状内皮增生病病毒癌基因同源物A(RelA)的mRNA表达量,显著升高了(P<0.05)肝脏半胱天冬蛋白酶(caspase)-3,6,8、Beclin 1的mRNA表达量和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ/Ⅰ的值以及Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达量;21日龄时,与Control和Saline组相比,腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)胸肌和腿肌p50、Bcl-2和RelA的mRNA表达量,显著提高了(P<0.05)胸肌和腿肌 caspase-3,6,8、Beclin 1 以及 Bax 的 mRNA 表达量,而腹腔注射 1.48 mmol/kg BW的H202显著降低了(P<0.05)胸肌p50和Bcl-2的mRNA表达量。42日龄时,与Control和Saline组相比,腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H2O2显著降低了(P<0.05)肝脏p50和RelA的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平,显著升高了(P<0.05)肝脏caspase-3,6,8的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平、Beclin 1的mRNA表达量和LC3-Ⅱ/Ⅰ的值以及LC3-Ⅱ蛋白表达水平、Bax的mRNA表达量,而腹腔注射1.48 mmol/kg BW的H2O2显著升高了(P<0.05)肝脏caspase-6的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平、LC3-Ⅱ蛋白表达水平和Bax的mRNA表达量;42日龄时,与Control和Saline组相比,腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H202显著降低了(P<0.05)胸肌和腿肌p50、Bcl-2和RelA的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平,显著升高了(P<0.05)胸肌和腿肌的caspase-3,6,8的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平、Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的mRNA表达量以及LC3-Ⅱ蛋白表达水平、Bax的mRNA表达量,而腹腔注射1.48 mmol/kg BW的H202显著降低了(P<0.05)胸肌的NF-κB蛋白表达水平以及腿肌的p50的mRNA表达量,显著升高了(P<0.05)胸肌caspase-3的mRNA表达量及其蛋白表达水平以及胸肌和腿肌LC3-Ⅱ蛋白表达水平。3.过氧化氢对小鼠成肌细胞的氧化损伤作用研究试验三:以体外培养的小鼠成肌细胞(C2C12)为研究对象,进一步探讨氧化损伤可能的路径。试验分为3个处理组,每个处理组6个重复。处理组分别为:(Ⅰ):对照组(Control),以DDMEM培养基培养的细胞作为空白对照,培养24 h;(Ⅱ):PDTC组(PDTC),以 1 mL/孔 20 μmol/L的PDTC孵育细胞24 h;(Ⅲ):H202组(H202),加入MTT法筛选出的安全浓度(0.5 mmol/L)的H202处理细胞24 h。结果显示:与Control组相比,PDTC组的总凋亡率、caspase-3,6,9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平、Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的mRNA表达量以及LC3-Ⅱ蛋白表达水平均显著增加(P<0.05),p50、Bcl-2、RelA和Cox-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平则显著降低(P<0.05);与Control组相比,H202组的细胞ROS水平、细胞总凋亡率、caspase-3,6,8,9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平、Beclin 1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的mRNA表达量以及LC3-Ⅱ蛋白表达水平,Bax的mRNA表达量均显著增加(P<0.05),而p50、Bcl-2、RelA和Cox-1,2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平则显著降低(P<0.05)。4.牛磺酸对过氧化氢诱导的肉鸡肌肉氧化损伤缓解作用及机制研究试验四:研究牛磺酸对高浓度ROS引起的肉鸡肌肉氧化损伤缓解作用和机制。选取192只28日龄健康AA肉鸡,随机分为3个处理组,每个处理组8个重复,每个重复8只鸡。3个处理组分别为:(Ⅰ):对照组(Control),不进行注射,饲喂基础日粮;(Ⅱ):H2O2组(H2O2),腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H2O2溶液,饲喂基础日粮;(Ⅲ):H2O2+牛磺酸组(H2O2+taurine),腹腔注射2.96 mmol/kg BW的H202溶液,饲喂0.5%的牛磺酸试验日粮。饲养期为14 d,并第14 d(42日龄)进行屠宰,屠宰前5天进行腹腔注射。结果显示:H2O2组的BWG、FI、相对肌肉重、胸肌的滴水损失以及H2O2组和H2O2+taurine组的胸肌和腿肌pH24h均显著低于(P<0.05)Control组,而H2O2组的F/G以及H2O2组和H202+taurine组胸肌和腿肌的剪切力则显著高于(P<0.05)Control组;与Control组相比,H202组胸肌的线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ活性以及膜电位、T-AOC和T-SOD、GSH-Px活性、总疏基含量显著降低(P<0.05),胸肌的ROS水平以及8-OHdG、AOPPs、羰基和MDA含量则显著升高(P<0.05),而H2O2+taurine组胸肌的T-SOD活性显著降低(P<0.05),胸肌的ROS水平以及AOPPs和MDA含量则显著升高(P<0.05);与Control组相比,H2O2组胸肌p50、Bcl-2和RelA的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平显著降低(P<0.05),胸肌caspase-3,6,8的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平、Beclin 1的mRNA表达量和LC3-Ⅱ/Ⅰ的值以及LC3-Ⅱ蛋白表达水平、Bax的mRNA表达量则显著升高(P<0.05),而H202+taurine组胸肌的p50和Bcl-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平显著降低(P<0.05),胸肌的caspase-3,6,8的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平、Beclin 1的mRNA表达量和LC3-Ⅱ/Ⅰ的值以及LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。此外,H202+taurine组的BWG、FI显著高于(P<0.05)H2O2组,而F/G以及胸肌的剪切力则显著低于(P<0.05)H2O2组;与H2O2组相比,H2O2+taurine组胸肌的线粒体复合物Ⅲ活性以及T-AOC和T-SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05),胸肌的ROS水平以及羰基和AOPPs含量显著则降低(P<0.05);与H2O2组相比,H2O2+taurine组p50和Bcl-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.05),胸肌的caspase-3,6,8mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平、Beclin 1的mRNA表达量和LC3-Ⅱ/Ⅰ的值以及LC3-Ⅱ蛋白表达水平则显著降低(P<0.05)。综上所述,得出如下结论:(1)H2O2引起的氧化应激能够降低肉鸡的生长性能,抑制肌肉发育并造成肉鸡肉品质的下降。H2O2能够增加肉鸡肝脏和肌肉的ROS水平,造成肉鸡胸肌线粒体功能的损伤,并对肉鸡肝脏和胸肌的组织形态和氧化还原状态有负面的影响。(2)H2O2引起的氧化应激能够促进肉鸡肝脏和肌肉的细胞凋亡和自噬发生,并且通过抑制NF-κB信号通路调控细胞凋亡和自噬过程,这可能是肉鸡机体氧化损伤的重要路径。(3)H2O2会引起C2C12细胞的ROS升高,并且能够通过抑制NF-κB信号通路介导细胞凋亡和自噬的发生,这与NF-κB因子的特异性抑制剂PDTC的作用相类似。(4)牛磺酸的添加能够抵抗H2O2对肉鸡生长性能和肉品质的危害,并在一定程度上缓解H2O2导致的肉鸡胸肌氧化损害。这可能是与牛磺酸下调了 H202导致的ROS水平升高,进而通过激活NF-κB信号通路调控肉鸡胸肌细胞凋亡和自噬的过程有关。