棘球蚴病(Echinococcosis)，又称包虫病，是棘球绦虫寄生于人体及某些动物体内所致的一种严重的人畜共患慢性寄生虫疾病。该病严重影响我国西部农牧民身体健康，在我国西北地区采取以预防教育为主的综合防治措施，经过多年努力，虽取得了一定的成效，但包虫病和家畜的包虫感染仍未得到有效地控制，我国仍然是包虫病发病最高的国家之一。随着我国经济的高速发展和现代生物技术的日新月异，研制分子疫苗的条件已经成熟，采用疫苗预防也是彻底控制包虫病在我国牧区流行的迫切需要。目前Eg95抗原被认为是最有效的侯选疫苗分子，构建细粒棘球蚴新疆Eg95基因疫苗，对于透彻了解Eg95疫苗抗新疆包虫感染的有效性和在家畜中的保护效果，以及为防治包虫病在人、畜间的传播，探索基因疫苗技术用于包虫病防治的有效性和实用性，开拓包虫病免疫控制的新方法具有重要的理论价值和潜在的应用前景。区Eg95抗原基因编码区的结构特点以及是否存在对Eg95抗原变异性的影响，本研究克隆了新疆Eg95抗原基因并对核昔酸序列进行了分析及比较，以检测新疆地区Eg95抗原基因的变异对于Eg95抗原编码的影响，为进一步构建 Eg95 DNA疫苗，以期为我国包虫病基因疫苗的研制奠定基础。 本研究用TRIZ＊试剂提取原头蝴DNA。根据已报道细粒棘球蝴95抗原基因序列设计PCR引物，用PCR方法分别从新疆细粒棘球蛔原头蝴（羊源，采自新疆乌鲁木齐市中环屠宰场〕基因组DNA及CDNA文库（张文宝博士馈赠）中，同时克隆获得Eg95抗原基因及Eg95抗原 CDNA。Eg95基因组 DNA及 CDNA PCR扩增产物经电泳鉴定后，利用pUCm－T载体的特性进行TA克隆，将Eg95基因组DNA及cDNAPCR扩增产物构建至pUCm1载体上，转化至感受态细胞、涂在选择培养基卜、通过蓝白菌落筛选，随机挑选阳性克隆株（白色菌落），用ECORI和XhOI酶切并进行PCR扩增鉴定pUC＊－T／Eg95阳姓克隆，将进行测序，确定两者的基因碱基序列。利用DNAman 软件及GenBank／BLAST功能，对其进行序列分析及同源性比较。 结果显示以原头蛔DNA为模板，用Eg95引物进行PCR扩增，可得到大小约为 1200hp的 DNA片段。测序结果显示Eg95基因组基因片段为1191hp，为一新基因，命名为Eg95／XJ，被GenBank收录（收录号：AF465599卜同源性分析表明Eg95伏J基因与新西兰株Eg95基因家族成员同源性达86％～97％，所有多核昔酸序列的差异均集中于非编码内含子区域，说明Eg95／XJ基因组序列及其结构都是非常保守的，因此，中国新疆地区的Eg95基因属于Eg95基因家族成员之一，但其序列与新西兰株Eg95基因之间存在一定的差异。Eg95基因内含于部分基因序列差异的生物学意义有待于进一步阐明。 为了进一步研究细粒棘球绦虫95抗原（Eg95）基因在新疆细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达及其基因序列是否存在差异。本研究根据细粒棘球绦虫95抗原基因序列设计引物，用PCR方法分别从新疆细粒棘球绦虫3个不同发育阶段（原头蝴、六钩锄和成虫）所构建的。DNA噬菌体文库中，克隆获得3个不同发育阶段的cDNA片段。测 一2－序结果表明其基因片段长度为402 hp，确定为Eg95抗原目的基因。功能分析表明编码 133个氨基酸。利用 DNAman和 GenBank／BLAST软件，将充隆的 3个不同阶段的 Eg95 cDNA序列与 GenBank中的 Eg95序列进行了同源性比较，序列分析结果显示，所克隆的新疆株rgos抗原基因与GenBank中的新西兰株Eg95抗原基因编码区序列一致，提示Eg95仪J基因在细粒棘球蝴绦虫生长发育中都有表达，因此可以作为靶基因开展进一步的研究。 在国内外棘球拗研究领域中，本研究首次从新疆地区细粒棘球原头锄基因中克隆了新疆Eg95抗原基回，发现其为一条新基囚，命名为 Eg95／XJ，登录十 GenBank（收录号：AF465599）。 本研究在国内外首欢证明新疆地区细粒棘球绦虫95 抗原基因在个同发育阶段（原头蝴、六钩蝉及成虫）均有表达，其CDNA基因序列无差异，表明Eg95抗原基因在细粒棘球绦虫的生长发育中是必不叮少的，为细粒棘球蜒感染的药物治疗、免疫预防和免疫干预提供了靶分于。因此，Eg95抗原基因可以作为候选疫苗分子用于进一步的研究。 第二部分 Eg95基因疫苗的构建、瞬时表达及免疫应答研究 本研究以pCDNA3为质粒载体，以Eg95抗原基回为口的基因，通过体外重组技术构建正确连接的PCDNA3－Eg95重组质粒。 用限制性内切酶分别酶切真核表达载体pCDNA3 和己扩增的Eg95 CDNA PCR产物，回收 DNA目的片段，利用双位点酶切定向克隆技术将Eg95 CDNA片段连接到真核表达载体pGDNA3上。根据选择标志的氨芋抗性基因筛选到阳性克隆，通过限制性内切酶双酶切分析。PCR鉴定及测序分析阳性克隆，确定是否为正向连接了Eg95基因的重组质粒。用脂质体转染的方法将pCDNA3Ig95重组质粒DNA导入体外培养的HeLa细胞中。TRIzol法提取转染后HeLa细胞总RNA，用RT．PCR法检测Eg95基因在转染HeLa