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乳腺癌是对女性健康构成最大威胁的一种恶性疾病,涉及多种基因异常,包括癌基因的激活、抑癌基因的失活等,其发展是一个多因素多阶段的过程。转移不仅是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一,更是影响乳腺癌患者治疗效果和导致死亡的主要原因,骨是乳腺癌最常见的远处转移部位之一。 分泌蛋白质组学不仅可以筛查参与乳腺癌发生和转移的相关分子,也可以为临床早期诊断和预测转移预后提供有效的生物标志物。本研究中,利用来源于乳腺癌MDA-MB-231细胞的遗传背景相同的具有不同转移能力的各种亚系SCPs(single-cell-derived progenies)细胞,通过分泌蛋白质组学检测,结果得到了38种差异蛋白。其中调节酶活性的蛋白中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatins)家族可能参与了乳腺癌细胞不同倾向转移能力的调控。结合全基因组表达芯片结果和甲基化芯片结果分析,认为cystafins家族成员CST6可能在乳腺癌骨转移中起重要的调节作用。 进一步的研究发现MDA-MB-231系列和MCF10AT系列不同转移能力的细胞中,CST6的mRNA和分泌蛋白表达水平与乳腺癌细胞的骨转移能力呈负相关。甲基化特异性的PCR(MSP)证实了低转移能力的细胞中甲基化水平相对较低,而高转移能力的乳腺癌细胞中甲基化程度较高。进一步通过重硫酸盐测序分析(BGS),发现不同转移能力的乳腺癌细胞系中CST6启动子区域的部分CpG岛中的甲基化水平存在着明显差异,提示作为受甲基化调节的基因,CST6参与了乳腺癌的骨转移。另外发现乳腺癌细胞经去甲基化药物5-氮-2’脱氧胞苷(Aza)处理后,细胞生长明显受到抑制,凋亡增加。 为了研究CST6在乳腺癌细胞中的作用,在低骨转移的SCP4,MCF10AT和中等偏弱骨转移SCP28中,构建shRNA后knock-down CST6,结果证明促进细胞生长增殖、克隆形成、侵袭和迁移。相反,在SCP28和高骨转移能力的SCP2,MCF10Ca1h和MCF10Ca1A中,过表达CST6,结果证明抑制细胞生长增殖、克隆形成、侵袭和迁移。此外,条件培养液中CST6蛋白水平的改变也可以影响细胞的侵袭和迁移,说明CST6是通过癌细胞的分泌作用从而发挥抑制肿瘤转移的作用。 体内乳腺癌细胞骨转移模型实验中,脂肪垫原位成瘤实验证实了过表达CST6可以抑制乳腺癌的生长和增殖。同时稳定过表达CST6的SCP2细胞注入裸鼠左心室,与对照组相比,利用Bioluminescence Image和X线检测发现CST6能抑制乳腺癌的骨转移,明显减弱了溶骨性损毁。CST6 knock-down的SCP4稳转细胞左心室注射后,与对照组相比,CST6则促进溶骨性损毁。 文献报道CST6对半胱氨酸蛋白酶的抑制作用具有一定的选择性,其中对legumain和cathcpsin B、L具有强有力的抑制作用。cathcpsin B、L及Icgumain的活性与乳腺癌的侵袭和转移能力存在正相关关系。研究表明CST6可以抑制cathepsin B和cathepsin L的活性,而legumain的活性则检测不到或没有变化,提示可能与不同的细胞系的来源有关。 综上所述,研究认为CST6可能在乳腺癌骨转移中起重要作用,进而通过体外实验证明作为受甲基化调节的基因,CST6可以抑制cathepsinB、L的活性,而且参与乳腺癌的发展和转移,而体内CST6抑制乳腺癌骨转移的机制则有待于进一步研究。我们的初步结果可以为临床上乳腺癌的诊断和治疗提供依据。