论文部分内容阅读
叶酸(folate)是一类水溶性B族维生素,是一碳单位代谢的核心成分,叶酸最高氧化状态folic acid(FA)是药物和膳食补充剂中常见的叶酸类型。外源叶酸在细胞中被逐级还原为5,10-亚甲基四氢叶酸,是由dUMP从头合成dTMP的主要甲基供体,因此叶酸缺乏可导致细胞DNA内dUMP/dTMP比值升高、dUTP大量掺入DNA,引起DNA碱基错配、DNA链和染色体断裂等基因组不稳定(Genomic instability,GIN)事件发生。错配修复(Mismatch repair,MMR)系统能通过纠正细胞复制和/或重组期间产生的碱基错配而维持基因组完整性,本文围绕叶酸缺乏对人结肠细胞基因组稳定性和miRNA-21-5p表达的影响、miR-21-5p对MMR系统核心基因hMSH2的靶向性与表达调控开展研究。旨在比较叶酸缺乏对不同生理病理状态的细胞基因组稳定性的影响差异,同时揭示miRNA响应叶酸缺乏并介导错配修复基因表达改变与机制。根据本实验室人淋巴细胞基因组稳定性维护的FA浓度,研究以FA缺乏浓度(22.6nM)和RPMI1640培养基标准FA浓度(2260nM)分别干预培养人结肠上皮细胞CCD-841-CoN和结直肠腺癌细胞Caco-2,在培养的第7天和21天,以胞质分裂阻断微核细胞组分析(cytokinesis-block micronucleus cytome assay,CBMN-cyt)评价并比较受试细胞的GIN水平;以Poly(A)加尾法、双荧光素酶报告基因检测系统分别分析miR-21-5p在FA缺乏时的表达响应及其对hMSH2的靶向关系;RT-qPCR和western blotting分析hMSH2在mRNA和蛋白层面的表达水平。结果显示:(1)当FA缺乏21天时,两株受试细胞GIN频率均显著提高(P<0.05),且以染色体断裂相关标志微核(micronucleus,MN)为主流(P<0.01);(2)miR-21-5p对hMSH2-3’UTR端具有靶向性;(3)在结肠上皮细胞CCD-841-CoN中,FA缺乏21天时miR-21-5p、hMSH2的转录水平显著上调(P<0.01);但未发现hMSH2蛋白水平明显改变;(4)在结直肠腺癌细胞Caco-2中,FA缺乏21天时,miR-21-5p转录水平显著上调(P<0.01),hMSH2 mRNA和蛋白表达均显著下调(P<0.01);提示miR-21-5p在不同的细胞内对靶基因hMSH2的表达调控存在差异。综上,本研究证实了FA缺乏诱发人结直肠细胞株GIN上升,损伤多以DNA链、染色体断裂为主;FA长期缺乏时,在Caco-2细胞中,miR-21-5p表达显著上调并抑制hMSH2 mRNA和蛋白水平的表达,提示miR-21-5p在肿瘤细胞中对DNA损伤修复的抑制潜能;但在CCD-841-CoN细胞中,尽管miR-21-5p、hMSH2转录表达上调,蛋白水平却无明显变化,提示在正常细胞中,miRNA-21-5p对hMSH2的负面调控效应可能还存在其他的补偿机制,以保证正常的DNA损伤修复。该研究提示miR-21-5p在不同细胞中介导的DNA损伤修复差异可能为肿瘤治疗提供新的线索。