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目的多西环素(Doxycycline,DOX)是一常用的四环素类抗生素,其对多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)细胞的抑制作用目前尚未有报道。本研究探讨DOX对MM细胞株H929和U266细胞增殖的影响及相关机制。方法1、MTT法观察DOX对H929和U266细胞增殖的影响。共设1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L六个不同的DOX浓度梯度,并设24h、48h、72h三个时间点;选用无DOX处理的作为阴性对照组,同时设置空白对照组。检测各组不同时间点吸光度值,计算细胞增殖抑制率。2、Western Blot法检测DOX处理H929和U266细胞后PARP、p-Stat1、pAkt、p-Erk1/2表达。实验分成四组:1)对照组A:无DOX处理组。2)实验组B:2.5mg/L的DOX处理MM细胞株3d。3)实验组C:5mg/L的DOX处理MM细胞株3d。4)实验组D:10mg/L的DOX处理MM细胞株3d。3、MTT法测定DOX联合Akt信号通路抑制剂哌立福辛(Perifosine)或单独Perifosine对U266细胞增殖的影响。对于联合处理组先单独用Perifosine处理U266细胞4h后,换不含Perifosine的、含5mg/L DOX的培养液处理3d。检测吸光度值,计算细胞增殖抑制率,研究Perifosine是否影响DOX对U266细胞株的增殖抑制作用。4、Western Blot法检测Perifosine处理U266细胞后p-Akt的表达。设Perifosine处理U266细胞株4h后立即检测组;先Perifosine处理4h后,换不含抑制的培养液继续培养3d组;持续5μM的Perifosine处理U266细胞株3d组;阴性对照组。检测各组U266细胞p-Akt蛋白的表达水平,研究Perifosine抑制Akt作用是否可逆。5、Western Blot法检测DOX联合Perifosine或单独处理U266细胞后对pAkt表达的影响。设单独5mg/L的DOX处理3d组和Perifosine处理4h后,再单独DOX处理3d组;以无任何药物处理组为阴性对照组。检测各组U266细胞pAkt表达水平,研究Perifosine是否可以抑制DOX上调p-Akt表达的作用。6、Real-time-PCR法测定DOX处理U266细胞后c-Jun和c-Fos基因表达。A组、B组、C组和D组细胞在DOX处理结束后,提取各组总RNA,测定四组细胞中c-Jun和c-Fos表达水平。结果1、不同浓度DOX分别作用MM细胞不同时间后,MTT结果表明随着DOX浓度和时间的增加,H929和U266细胞增殖抑制率增加(P<0.05),提示DOX可抑制MM细胞株H929和U266细胞的增殖,并且这种抑制作用呈现时间-剂量依赖关系。2、与对照组比较,DOX处理后可抑制H929和U266细胞p-Erk1/2表达(P<0.05),上调H929细胞中p-Stat1表达(P<0.05),而对U266细胞p-Stat1的表达和这两种细胞株PARP的表达无明显改变;2.5和5mg/L浓度的DOX可以上调MM细胞株p-Akt的表达(P<0.05),这一上调作用可以被Akt通路抑制剂Perifosine所阻断,并且这种抑制Akt的作用呈现不可逆性。此外,MTT结果还提示Perifosine可增强DOX对U266细胞株的增殖抑制作用。3、Real-time-PCR结果表明:DOX处理U266细胞后c-Fos基因mRNA表达水平下调(P<0.05)。结论1、DOX对H929和U266细胞的增殖有抑制作用,并且其抑制作用有明显的时间剂量依赖性。2、DOX可以影响MM细胞中与细胞增殖有关的Erk、Stat、Akt信号通路。