突触可塑性是神经元之间突触强度或效能在经历各种环境变化时产生的适应性改变,是人和动物大脑最关键的特性之一。突触可塑性不仅在神经环路发育及形成过程中发挥重要作用,还与学习记忆和多种神经源性及精神源性疾病的发生发展密切相关。突触可塑性的形成是多种信号分子传递、受体激活和基因表达调控的结果。普遍认为,神经细胞突触后膜N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDA受体)激活在突触可塑性的形成中发挥重要作用。NMDA受体激活,触发钙离子内流,进一步激活多种蛋白激酶,如细胞外蛋白调节激酶(extracellular regulated proteinkinases 1/2,Erk1/2)、钙/钙调素依赖性蛋白激酶 2(Ca/calmodulin-dependent protein kinases Ⅱ,CaMKⅡ)和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)等,继而促进与突触可塑性相关基因的表达。突触可塑性变化常被认为与一组即刻早基因(immediate-early response genes,IEGs)的表达相关。IEGs往往在细胞受到刺激后最先表达,包括C-Fos基因,细胞骨架活性调节蛋白(activity regulated cytoskeleton associated protein,Arc)和早期生长反应蛋白 1(early growth response protein 1,Egr1)等。C-Fos基因是一类核蛋白转录因子,不仅调控细胞的生长分化,还常作为神经元激活的标志分子,C-Fos的表达还同树突的延伸有关。Arc也属于早期反应因子,在神经元受刺激后迅速产生,并积聚在激活神经元树突的突触活性位点处,参与调节早期突触可塑性。Egr1也是一个重要的调控突触可塑性的转录因子,新近的研究发现,海马齿状回中长时程增强的诱导需要神经元内Egr1的快速转录。当然,一些晚期反应基因如脑源性生长因子、环磷腺苷效应元件结合蛋白等也参与了突触可塑性的调节。尽管这些基因还有多种其他功能,但被认为是调节突触可塑性的关键基因。这些基因常常通过调节突触可塑性进程来参与学习记忆等神经活动,并与多种神经源性疾病的发生相关。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)是在糖酵解、三羧酸循环及乳酸变为丙酮酸的过程中产生的还原态分子,不仅参与呼吸链中电子传递,还可通过活化机体中的多酶系统而促进体内营养物质的合成与代谢。因此,NADH广泛参与细胞氧化还原水平及能量代谢的调节。当NADH产生较多时,细胞内NADH/NAD+的比率提高,神经元处于还原状态,此时NMDA受体上对于氧化还原敏感的NR1亚基可能被激活,NMDA受体活性增强从而发挥生理功能。除了上述功能外,NADH还可作为信号分子调节多种生物进程如钙稳态、基因表达等。近来研究提示,NADH可能作为一种信号分子参与突触可塑性及相关IEGs基因表达的调节。首先,调节NADH/NAD+生物合成可调控突触可塑性变化。如烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)是其合成中一种必须的物质,Nampt基因敲除鼠长时程抑制和学习记忆明显受损。其次,调控NADH/NAD+的分解也调控突触可塑性,如一种NAD+依赖性去乙酰化酶(SIRT1)可以直接促进神经元突触可塑性的变化。新近研究也发现,乳酸在调节突触可塑性中主要通过乳酸代谢产生的NADH,而非丙酮酸来进行突触可塑性和IEGs表达的信号传递。这些研究提示NADH可能作为一种信号分子调控了突触可塑性变化,那么可能的分子机制尚需进一步阐明。鉴于以上研究背景,我们设想NADH分子可能作为信号分子调控神经元突触可塑性变化,处于还原状态下的NADH可激活NMDA受体,而引起Ca2+信号分子及关联分子通路激活,进而促使IEGs的表达,引起神经元的突触可塑性变化。为了验证我们的设想,进行了以下实验:(1)培养原代脑皮层神经元,分别加入不同浓度的NADH(1,2,4,8,16mM),作用 1h 后经 RT-PCR 检测 IEGs(C-Fos,Arc,Egr1)的表达,选取NADH作用的合适浓度。然后在NADH作用不同时间(20,40,60,120,240min)时检测IEGsmRNA及蛋白水平变化,观察NADH引起IEGs表达变化的时间关系。(2)给与NMDA受体的非竞争性拮抗剂MK-801特异性阻断NMDA受体,分别通过RT-PCR及western blot实验检测NADH作用后IEGs的mRNA及蛋白表达变化情况,并通过sholl分析检测神经元形态变化,分析NMDA受体在NADH调节突触可塑性过程中的作用。(3)进一步分析Ca2+离子及下游分子Erk1/2蛋白变化。应用钙离子荧光探针Fluo-4AM染料孵育神经元后,在激光共聚焦显微镜下记录下不同处理条件下胞内钙离子浓度变化的实时轨迹,即在活细胞水平分析NADH对皮层神经元钙离子浓度时程的影响,并通过western blot检测Ca2+信号下游分子Erk1/2蛋白表达变化,经U0126(10μM)特异性阻断Erk1/2分子后,进一步分析IEGs的表达变化。(4)在动物水平上,将NADH(8mM)经脑立体定位仪引导注射至小鼠额叶皮层内,1h后取材脑组织通过RT-PCR检测IEGs的表达变化,并将含有钙离子指示剂GCaMP6腺相关病毒注射至额叶皮层,2w后在相同位置注射8mMNADH,1h后取脑切片,于荧光显微镜下观察Ca2+信号变化。还设计实验将含C-Fos启动子的病毒载体GV581注射至额叶皮层,通过荧光蛋白反应C-Fos表达,进而分析NADH对神经元激活的影响。实验结果显示:(1)NADH能够促进脑皮层神经元IEGs基因,包括C-Fos、Arc和Egr1的表达,且具有浓度和时间依赖性。当NADH浓度为1,2,4,8mM时,IEGs的表达量随NADH浓度升高而逐渐增加,8mM时IEGs表达量达到峰值,C-Fos、Arc和Egr1的mRNA水平分别为对照组的7.2倍,4.8倍和5.1倍。IEGs的表达量还随着NADH作用时间延长而增加,大约于1h达峰值,2h时恢复至正常水平。(2)给与MK-801特异性阻断NMDA受体后,几乎完全抑制了 NADH对IEGs的促表达作用,C-Fos、Arc和Egr1的mRNA和蛋白表达量均恢复到了对照组水平。Sholl分析结果显示,当MK-801与NADH共处理皮层神经元时,神经元初级突起和树突分支的数目较NADH处理组均显著减少,即MK-801抑制NADH作用下神经元的突起生长。3)Ca2+时程检测显示,加入8mMNADH后,神经元中Ca2+荧光信号急剧增强,神经元胞体呈现明亮的绿色荧光。而在加入NADH前给与MK-801处理,未检测到荧光强度的明显变化。此外,当细胞外液中不含钙离子时,NADH引起胞内Ca2+浓度升高的作用也被阻断。进一步的研究,抑制NMDA受体下游相关分子Erk1/2,发现NADH作用后IEGs的表达没有明显变化,说明Ca2+/Erk1/2是NADH调控突触可塑性的主要分子通路。4)体内实验结果显示,将8mMNADH注射至小鼠脑额叶皮层可明显增加IEGs基因的表达,其中Egr1的表达量增加最明显,约为对照组的17.5倍;C-Fos和Arc的表达亦明显增加,分别为对照组的6.3和5.9倍。钙离子指示剂GCaMP6脑内注射结果显示NADH明显增加皮层神经元钙离子信号。在GV581病毒注射鼠脑后,也发现NADH明显增加C-Fos表达,促进神经元的激活。综上所述,本实验结果表明经细胞代谢产生的还原态分子NADH,能够促进IEGs的表达和突触可塑性变化,其可能的机制是经NMDAR/Ca2+/Erk1/2分子通路来实现的。本研究为理解NADH在神经突触可塑性中的调节作用及机制提供了实验依据。