目的研究乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）介导的大鼠脑血管释放的内皮超极化因子（endothelium-derived hyperpolarizing factor, EDHF）对大鼠脑组织缺血-再灌注损伤和神经细胞缺氧-再给氧损伤是否具有保护作用及其可能的机制。方法1.在体实验:利用大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）损伤模型,以1μmol·L-1ACh从大鼠颈总动脉（common carotid artery,CCA）注入大脑血管中,结合PGI2和NO合成阻断剂NG-nitro-L-argininemethyl ester（L-NAME）和indomethacin（Indo）的应用,刺激脑血管释放EDHF,并以高浓度KCl（25 mmol L-1）作为EDHF的合成阻断剂,观察了脑血管释放的EDHF对大鼠的脑梗死面积、脑含水量和血清中乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH）、丙二醛（malonaldehyde, MDA）的影响。2.离体实验:应用PC12细胞及原代培养大鼠海马神经元细胞缺氧-再给氧损伤模型,结合PGI2和NO合成阻断剂L-NAME和Indo的应用,直接将ACh（终浓度1μmol·L-1）作用于分离的大鼠大脑中动脉（middle cerebral artery, MCA）血管段,使其释放EDHF,并以终浓度25 mmol L-1的KCl、膜渗透性钙离子螯合剂BAPTA-AM及钙调素拮抗剂氯丙嗪（Chlorpromazine,CPZ）作为EDHF的合成阻断剂,观察了大脑中动脉血管段释放的EDHF对PC12细胞和原代培养大鼠海马神经元细胞的MTT染色吸光度、细胞培养上清液中LDH活力的影响,另外,分别用Hoechst法和流式细胞仪（flow Cytometry, FC）法检测了大鼠MCA血管段释放的EDHF对原代培养大鼠海马细胞凋亡的影响,用激光共聚交显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM）观察了EDHF对原代培养大鼠海马细胞中游离钙离子浓度的影响,也用Western blot法观测了EDHF对海马神经元细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase, erk1/2）表达的影响。结果1.在体实验结果与假手术组相比,MCAO模型组大鼠的脑梗死面积明显增加（假手术组大鼠的脑梗死面积为0）,脑含水量和血清中LDH和MDA含量则显著性增多;与MCAO模型组比较,ACh组和ACh+L-NAME+Indo组的大鼠脑梗死面积显著性减小,脑含水量及血清中LDH活力和MDA含量也明显降低,而ACh+L-NAME+Indo+KCl组的各项指标与模型组无明显区别。实验结果表明,ACh作用于脑血管后能产生抑制大鼠MCAO损伤的保护作用,此保护作用含有非NO和非PGI2的作用成分,该作用成分与脑血管内皮释放的EDHF关系密切。2.离体实验结果1)PC12细胞实验:与正常培养的细胞比较,缺氧-再给氧损伤模型组MTT染色吸光度都显著降低,培养上清液中LDH活力明显升高;与模型组相比,在ACh+MCA/endo组和ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo组,由缺氧-再给氧所致的细胞MTT染色吸光度降低及培养上清液LDH升高受到显著性抑制,但单独ACh组、单独MCA/endo组、ACh+MCA（去内皮）组没有上述抑制作用;与ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo组比较,ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo+KCl组和ACh+MCA/endo（预温浴BAPTA-AM）+L-NAME+Indo组及ACh+MCA/endo（预温浴CPZ）+L-NAME+Indo组的细胞MTT染色吸光度有明显降低,培养上清液中LDH活力则都明显升高。结果表明,ACh作用于大鼠MCA血管段后能产生抑制PC12细胞缺氧-再给氧损伤的保护作用,此保护作用既不是由单独的ACh产生,也不是由单独的MCA产生,且具有血管内皮依赖性,此外,这种保护作用含非NO和非PGI2的作用成分,此作用成分与大鼠MCA内皮释放的EDHF密切相关。2)原代培养大鼠海马神经元细胞实验:○1 MTT和LDH的检测:与正常对照组比较,缺氧-再给氧模型组细胞的MTT染色吸光度明显降低,培养上清液中LDH活力明显升高;与模型组细胞比较, ACh+MCA/endo组和ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo组对由缺氧-再给氧所致的细胞MTT染色吸光度的降低及培养上清液LDH活力的升高有显著抑制作用,而单独ACh组、单独MCA/endo组和ACh+MCA（去内皮）组则无上述抑制作用;与ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo组比较,ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo+KCl组和ACh+MCA/endo（预温浴BAPTA-AM）+L-NAME+Indo组及ACh+MCA/endo（预温浴CPZ）+L-NAME+Indo组细胞MTT染色吸光度有明显降低,培养上清液中LDH活力则都有明显升高。○2细胞凋亡的检测:正常对照组的海马神经元细胞的凋亡率很低,而缺氧-再给氧损伤模型组细胞的凋亡率大幅度升高;与模型组比较,单独ACh组、单独MCA/endo组和ACh+MCA（去内皮）组的细胞凋亡率变化不大,而ACh+MCA/endo组和ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo组的细胞凋亡率则有显著性降低。○3细胞内Ca²⁺浓度的检测:与正常对照组比较,缺氧-再给氧损伤模型组海马神经元细胞内Ca²⁺荧光强度明显升高;与模型组比较, ACh+MCA/endo组、ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo组细胞内Ca²⁺荧光强度有显着性降低,而ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo+KCl组细胞内Ca²⁺荧光强度则无明显降低。○4erk1/2和p-erk1/2表达的检测:正常培养的海马神经元细胞p-erk1/2表达较多,缺氧-再给氧模型组海马神经元细胞p-erk1/2的表达有所减少;与模型组比较,单独ACh组、单独MCA/endo组和ACh+MCA（去内皮）组细胞的p-erk1/2的表达没有变化,而ACh+MCA/endo组和ACh+MCA/endo+L-NAME+Indo组细胞p-erk1/2的表达有所增多。非磷酸化erk1/2的表达在各组中基本没有变化。上述所有结果表明,ACh作用于大鼠MCA血管段后能产生抑制原代培养海马神经元细胞缺氧-再给氧损伤的保护作用,此保护作用既不是由单独的ACh产生,也不是由单独的MCA产生,具有血管内皮依赖性,此外,这种保护作用含非NO和非PGI2的作用成分,且此作用成分与大鼠MCA血管段内皮释放的EDHF关系密切,这种EDHF相关的细胞保护作用成分机制与降低神经细胞内游离Ca²⁺浓度及上调神经细胞erk1/2磷酸化有关。结论乙酰胆碱介导脑血管内皮释放的EDHF对脑组织缺血再灌注损伤有显著性保护作用,对PC12细胞和原代培养神经元细胞的缺氧再给氧损伤也有保护作用,其机制可能与减轻细胞内钙超载和减弱氧化损伤及上调erk1/2磷酸化有关。