研究目的 胃癌在我国仍是一种病死数居首位的恶性肿瘤。目前，临床上的—些常规方法，包括外科手术的、化学的及物理的治疗手段，对绝大多数中晚期胃癌的疗效均不理想。其原因在于这些常规方法对癌细胞缺乏选择性，并不能特异性地杀伤癌细胞，势必造成残存癌细胞引起的肿瘤复发和转移。某些常规方法，如化疗，在杀伤癌细胞的同时，也会造成机体正常组织的损伤并削弱机体的免疫机能。因此，针对胃癌的靶向治疗研究一直是胃癌研究领域的一个热点问题。由于许多肿瘤特异性抗原或相关抗原被发现以及抗体具有独特而优越的性能，抗体介导的肿瘤靶向治疗一直受到广泛关注。MG₇单抗是我所研制的一株小鼠抗人胃癌单克隆抗体，既往研究表明单抗对其相应抗原的识别具有较高的特异性和敏感性。本研究旨在利用噬菌体呈现技术制备MG₇单链抗体，为利用其进行胃癌的靶向治疗研究奠定实验基础。 方法 1．MG₇杂交瘤细胞的培养及利用ELISA检测MG₇单抗的抗原结合活性。 2．MG₇重组噬菌体抗体库的构建及鉴定 从培养的MG₇杂交瘤细胞中提取并分离mRNA，反转录成cDNA；利用PCR分别扩增MG₇单抗的重链及轻链可变区基因，并通过—DNA连接子将二者连接起来形成MG₇单链抗体基因；将MG₇单链抗体基因插入pCANTAB5E；将连接产物转化感受态TG1大肠杆菌，制备细菌形式的MG₇重组噬菌体抗体库；通过菌落计数和限制性酶切分析（EcoRⅠ和HindⅢ）评估MG₇重组噬菌体抗体库的容量和重组率。 3．MG₇重组噬菌体抗体库的淘筛 用M13KO7辅助噬菌体感染转化菌，以挽救出噬菌体形式的抗体库；用高表达MG₇抗原的胃癌细胞系KATOⅢ对抗体库进行三轮淘筛；用ELISA筛检呈现有MG₇ScFv的噬菌体单克隆。 4．MG₇重组噬菌体抗体阳性克隆的抗原结合性检测 第四军医大学博士学位论文 用 ELISAslwnm筛彬帕MG7ttflixK，tM－．－x阳性克④到驶知烘扳原kbbjg)浊 对阳性克隆进行限制陇卧赐析（uWI和Hedlll）鉴定三用竞争ELISAtolJMG7 重组噬菌体抗体 性克隆对MG7单扶与其相应抗原结合忙的喇率，从中j)ed出对MG7 单抗与期眩抗原结合有抑余J效应的克隆用于进一涉研究。 5．7］－u＊＆ MG7ScF 64kiLsrj 将上述竟争EU趴中筛蹦u的Mo重组咱箔列莉b体阳性克隆感染H BZB2151大肠杆 菌，经 IPTG诱导表达可溶11 MG7 SchV： 牛愤 IPTG M菌的周质提取物。 6．用免度长印过u知险钡l］周质摈毋哟和卜细茵培养上清中可陀自性MoscFV的含量。 7．刁D自吐MoSCF抗原结合活性的0 用ELISA湖腑性MoMV与斯晌觎的结合呼b快用静ELI即棚账 性 MG7ScFv对 MG7单扩与期晌抗原结合6U’i，’liil率。 8．用 Wt blOt法档团何溶牲MoSCFv的＃眩囚吁量。 9．MG7Schv4k44R｝Y列的测定 牙用 ABI PRISMwMw叨 DM自辆e 结果 二 经 ELISA检刃帖。见 MG7单抗具有明显的抗原结合活性，其A．uxl．《直为 0．65，高出阴 性对照（0．208）三倍以上。 二．经琼月副琼阂狡电泳分析发现＊o单淀彭勃链细呵变区基因片删50大约是 350 hp和 320 hp，MG7 ScF基因片洲跟蛐是 7to hp。 3．菌…MG7 tina…的雏o是2XI 炉。 4 F蛐性酶切吩斩发现在11个随初束物沤一中有8个为重组子，表明该抗体库 的重组率约为72．70。 5．邮MG7 tfgxm4～xtl～ozrnslao筛后，通过ELISAAn15ng自富集6尔茧菌体 脏中讨筛濒帕 个阳性克隆。 6．对初次筛u的6个MG7 tifing菌体抗体阳性克隆重复ELISA档钡帐琐k炽有嵌原 结合活比经限制性酌叔哆定均为重组于经竟争巳旧A档坝歧砚6个阳性克隆＋仅 有 2个克隆对 Mo单教与其相应湖的结合具有功喇活fi，侧蝴0是26．1O和 30％． 7 对2个具有竞争活蛐Mo噬阂刺祈砧凋出纳呵溶出的垢，免疯长(阳钻眯城泼 现2个克隆均有较高产量的可容性ScFv表进 4 第四军医大学博士学位论文8．EL旧A拐成惴现2个克隆的可容牲MG7 S ee M明显的抗原结合舌队其a分 别为0．832和0．912，均高出附性对照（0．201）三倍以上静巳I趴伽一中 仅有1个允割9可容性MoSdy对Mo单扩与斯赃抗原的结合具有抑制活性，其 抑制率为32．2％。9．WW blOt o歧规可溶＆ MG7 ScFv 6树驭怕吁量N为 30 kDa。10．DNA＄恃发现MG7thettMA18＆q－变隧因片o4长色扣IJ是3Dto和321 o； Ae＆：，］－变区的67ebp和ZtoQ91bp ｛iIJI＝M＊l］有两＋＄x！ytaw．eeut附， 在轻链可变区的4724N中和旺讨o无一位u有两个5密码 子；Mo抗体重链?