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【目的】构建ADAM10条件性基因打靶载体,为制备ADAM10条件性基因敲除的小鼠模型和研究ADAM10基因的功能奠定基础。【方法】运用长片段PCR技术,从129/SVJ小鼠基因组中分步扩增ADAM10基因第二外显子及其两端作为同源臂的侧翼序列,长度分别为6.2kb和6kb。经测序鉴定后,将外显子以及上下游同源臂片段分别连接于基因打靶骨架载体pL451上,构建了基因打靶中间载体pEFUD。再从pSSC9载体上酶切下HSV-TK基因,连接于pEFUD,最终构建成ADAM10条件性基因打靶载体pEFUD-TK。为了验证载体上正负双向选择基因的功能,分别以环状和线性pEFUD-TK为实验组,pSSC9、pL451和空转为对照组,采用脂质体2000(LP2000)转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),研究Neo基因和HSV-TK基因的表达活性。【结果】:克隆的ADAM10基因第二外显子及侧翼序列的酶切图谱与公布的129/SVJ小鼠相应序列的酶切图谱相一致。测定的序列与数据库公布的小鼠相应序列基本相同(99.8%)。其中,第二外显子序列与公布的小鼠序列完全一致。外显子与上、下游同源臂序列均正确地连接于pLA51载体,来源于pSSC9的HSV-TK基因经过测序均与报道的HSV-TK基因序列完全相同,因此成功构建了ADAM10条件性基因打靶载体。用LP2000转染SH-SY5Y细胞,G418(850ng/ml)筛选10天后,空转对照组细胞全部死亡,pEFUD-TK环状实验组、pEFUD-TK线性化实验组、pL451和pSSC9对照组均有少量细胞存活,并形成小的细胞集落;细胞再经GCV(10ng/ml)筛选,72小时后,环状和线性pEFUD-TK实验组以及pSSC9对照组均有大量细胞死亡,G418筛选后形成的细胞集落大部分消失,pL451对照组基本无细胞死亡,原有的小细胞集落继续生长。【结论】:成功构建并鉴定了ADAM10基因条件性基因敲除打靶载体(pEFUD-TK),载体中正负双向选择基因能够发挥正常的功能。