T细胞的活化需要双信号的刺激，T细胞抗原受体特异性识别MHC/抗原肽产生第一信号，共刺激分子的活化产生第二信号。共刺激分子和共抑制分子统称为共信号分子。免疫球蛋白超家族（IgSF）中的共刺激分子CD28和ICOS具有促进T细胞活化的作用，而共抑制分子CTLA-4、PD-1和新近发现的B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子（B and T lymphocyte attenuator， BTLA）具有抑制T细胞的作用。 BTLA分子具有IgSF的结构特征，胞外段包含一个免疫球蛋白可变区样结构域（IgV），胞内含有两个免疫受体酪氨酸抑制性基序（ITIMs）。ITIMs磷酸化，可以募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，产生抑制效应。BTLA在小鼠B淋巴细胞上表达量很高，T淋巴细胞和DC上的表达次之，巨噬细胞的表达在不同小鼠中具有多态性，NK细胞表达很少。在T细胞活化过程中，BTLA表现出和CTLA-4、PD-1不同的调节模式。CTLA-4和PD-1诱导活化后表达在T细胞上，BTLA组成性表达在T细胞表面，活化后维持高水平表达。研究表明，BTLA可以抑制T细胞的增殖及IL-2和IFNγ的分泌，BTLA-/-T细胞对DC提呈的抗原刺激增殖更明显。尽管BTLA属于IgSF成员，然而其配体却是TNFR家族的HVEM。这是两大家族相互作用的唯一分子对，更特别的是，BTLA具有抑制T细胞的功能，而HVEM却可以活化NF-κB和AP-1，增强T细胞反应。HVEM表达在静止T细胞和未成熟DC细胞上，随着T细胞活化和DC的成熟，表达降低，HVEM和FNF家族配体LIGHT结合，可以下调HVEM的表达。用LIGHT刺激HVEM能够维持T细胞的存活和炎症反应。然而，表达在抗原提呈细胞上的HVEM和HVEM-Fc融合蛋白和T细胞上的BTLA结合后，产生抑制T细胞的作用。小鼠的研究表明，BTLA信号可以防止自身免疫性疾病的发生，终止炎症反应，抑制移植免疫应答，因此，BTLA信号在外周免疫耐受的调节中，具有重要作用。 BTLA/HVEM/LIGHT的表达和作用方式，构成了复杂的调节网络，连接了IgSF和TNFR两大家族的信号，因此是T细胞精确而又细微的调节自身活化的重要机制，在适时终止过度激活的免疫应答中具有重要作用。 本研究首先分析了BTLA在人T细胞活化的起始和早期阶段免疫应答中的调节作用。进而以人Treg细胞作为研究对象，揭示了BTLA信号是Treg细胞发挥抑制T细胞免疫应答的新途径。最后以表达人HVEM的基因转染细胞免疫小鼠，成功研制了一株鼠抗人HVEM的单克隆抗体。 第一部分、交联鼠抗人BTLA单抗或HVEM-Fc融合蛋白介导BTLA对T细胞活化的抑制。 目的：利用鼠抗人BTLA单克隆抗体8H9和HVEM-Fc融合蛋白的不同作用方式，观察它们对T细胞的作用，为探讨BTLA在T淋巴细胞上的功能提供研究手段。 方法：分离人外周血单个核细胞，经阴性选择磁珠分离纯化获得T淋巴细胞，流式细胞术检测BTLA在不同T淋巴细胞亚群上的表达。进一步用PHA或激发型抗人CD3单抗包板刺激T淋巴细胞活化，MTT法检测游离、包被以及抗Fc段二抗交联的8H9或HVEM-Fc融合蛋白对T淋巴细胞增殖的抑制作用。 结论：BTLA单抗8H9及HVEM-Fc融合蛋白经包被或抗Fc段二抗交联后可以介导BTLA对T细胞活化的抑制作用，但游离在液体中则不能激发BTLA信号，利用这一生物学特性为进一步研究BTLA对T细胞免疫应答的调节作用提供了有效的手段。 第二部分、BTLA对T细胞活化的起始和早期阶段免疫应答的调节。 目的：观察BTLA在T细胞上的表达并探讨其在各个阶段不同时相对T细胞活化的抑制。 方法：分离人外周血单个核细胞，经阴性选择磁珠分离纯化获得T淋巴细胞。流式检测新鲜分离T细胞上BTLA、HVEM、LIGHT、CTLA-4和PD-1的表达；用CD3抗体刺激T细胞活化，比较BTLA、CTLA-4和PD-1在T细胞活化过程中的动态表达。CD3抗体在加入或不加入BTLA单抗8H9的情况下刺激T细胞活化，流式细胞术检测早期活化标志分子CD25和CD69的表达。CD3抗体单独或联合CD28抗体活化T细胞，在不同的活化时间，MTT检测BTLA单抗8H9对T细胞增殖的影响。外周血单个核细胞经贴壁，GM-CSF和IL-4体外诱导生成未成熟DC，CD40抗体刺激DC成熟，流式检测HVEM在DC上的表达。用DC诱导异基因T细胞活化，加入游离8H9或抗HVEM抗体，阻断HVEM和BTLA结合，MTT检测T细胞增殖。 结论：BTLA可以提高T细胞的活化阈值，抑制T细胞早期活化分子CD25和CD69的表达，在T细胞活化的起始和早期阶段发挥重要的负性调控作用。 第三部分、HVEM在人CD4+CD25+调节性T细胞上的表达及功能研究。 目的：研究HVEM在人CD4+CD25+调节性T（Treg）细胞上的表达及其对Treg细胞功能的影响。 方法：分离人外周血单个核细胞，磁珠纯化获得T细胞及其不同亚群，流式细胞术检测CD3+T细胞和Treg细胞上HVEM的表达。用CD3抗体分别活化CD3+T细胞或Treg细胞，流式检测HVEM的动态表达。Treg细胞按不同比例分别与去除Treg细胞的CD3+T细胞、CD4+CD25-T细胞或CD8+T细胞混合培养，加入抗HVEM抗体或同型对照抗体，并用CD3抗体单独或联合CD28抗体刺激T细胞，MTT检测T细胞增殖。 结论：HVEM在Treg细胞上高表达介导了Treg细胞对效应T细胞的抑制功能，是Treg细胞通过细胞之间直接接触发挥抑制作用的又一新分子。 第四部分、鼠抗人HVEM单克隆抗体的研制。 目的：研制鼠抗人HVEM单克隆抗体，为探讨HVEM/BTLA相互作用对人T细胞的抑制性调节提供研究手段。 方法：以高表达人HVEM的转基因细胞L929/HVEM为免疫原，常规免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，并以转基因细胞L929/HVEM和L929/mock分别作为阳性和阴性筛选细胞。采用间接免疫荧光标记法流式细胞术筛选杂交瘤克隆。经多次克隆化培养，获得特异性分泌鼠抗人HVEM分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用细胞核染色体计数、Ig亚类快速定性试纸法对所获杂交瘤和单抗进行鉴定。用间接免疫荧光法初步分析单抗与T细胞及DC上HVEM的结合反应，并用MTT法检测其对Treg细胞抑制效应T细胞增殖的影响。 结论：成功获得1株稳定分泌鼠抗人HVEM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而为研究HVEM/BTLA抑制信号对T细胞的调节作用提供了物质手段。 综上所述，本研究应用BTLA单抗8H9和HVEM-Fc融合蛋白模拟BTLA信号，表明包被和交联的单抗或Fc融合蛋白可以激发BTLA信号，而游离在液体中，不能产生抑制信号，这为研究BTLA的功能提供了手段；BTLA信号能抑制T细胞早期活化分子CD25和CD69的表达，提高T细胞活化阈值，并在T细胞活化的48h内可以发挥抑制作用，即T细胞活化的起始和早期阶段发挥抑制作用，这有助于更全面和深入地理解负性信号分子在免疫应答中的作用和地位；CD4+CD25+Treg细胞高表达HVEM，并且HVEM/BTLA相互作用介导了Treg细胞抑制效应T细胞的作用，从而为Treg细胞在免疫治疗中的作用提供了新思路。最后，以L929/HVEM为免疫原免疫小鼠，研制获得1株特异性鼠抗人HVEM单克隆抗体，为研究HVEM/BTLA抑制信号对T细胞的调节作用提供了手段。