黄病毒属包括70多种病毒,其中绝大多数是节肢动物传播的人类病原。日本脑炎(JE)是一种蚊虫传播的病毒疾病,年发病率约为十万分之一,病死率约为5-40%,另有20-40%会引起严重的神经性疾病和后遗症。我国除新疆,西藏,青海外均有发病,现在每年仍有几千例病人,对人民的健康造成极大的危害,被卫生部列为乙类传染病。黄病毒基因组有一个显著特性,其RNA具有自主复制能力、同时具有感染性,裸RNA进入敏感细胞后,能够大量自主复制,并且进一步翻译成相应的病毒蛋白,在胞内包装成为完整的病毒颗粒。黄病毒复制子通常指将基因组上的结构基因部分切割下来,而保留完整的非结构蛋白基因,这样亚基因组RNA保留了自主复制能力,其不但能够表达非结构蛋白,而且能够表达保留的结构蛋白和/或添加的外源基因。理论上讲,这种亚基因组的复制能力等同于完整的基因组,正链RNA呈指数级增加。如果在这种复制子中插入外源基因,由于复制子RNA在细胞胞浆内大量扩增,就使得外源基因得到有效表达,因此,复制子RNA可作为表达外源基因的良好载体。目前,黄病毒中的KUN、DEN和YFV复制子已经被报道可以作为发展新型疫苗的潜在的有用的工具。而在本研究中,我们希望以JEV SA14-14-2株为基础,构建JEV亚基因组复制子,并进一步建立JEV复制子载体系统,用于更多的疫苗研究。我们先后构建了pMW-G2R~pMW-G4R系列JEV复制子。这些复制子的主要区别在于结构蛋白编码序列删除的方式不同,MCS,FMDV-2A等序列的添加。复制子的稳定性是构建复制子的一个主要问题,我们先后选用了不同的质粒载体用于作为复制子的骨架载体,为了促进复制子的稳定性,最终我们使用了一个极低拷贝但稳定性很好的细菌质粒载体pMW-118。另外,我们为了后续实验操作的方便,以及提高复制子载体的表达效力,在复制子载体上添加了CMV启动子序列,构建了pCMW-2M复制子载体,多次测序证明JEV复制子pCMW-2M于30℃在大肠杆菌Top10繁殖过程中十分稳定,没有突变、插入或缺失。我们通过间接免疫荧光实验(IFA)分析了JEV复制子转染BHK-21细胞病毒蛋白的表达。抗原主要定位在胞浆。这些抗原阳性的细胞同对照细胞形状、大小一致。在JEV抗原阳性的细胞没有观察到任何明显的细胞病变效应(CPE)。pMW-G2R~pMW-G4R和pCMW-2M复制子转染细胞IFA的阳性率差别很大,从1%~30%不等,表明C蛋白的完整性、CMV启动子的存在及非结构蛋白基因的正确表达对复制子载体表达病毒蛋白的能力影响至关重要。我们分别将绿色荧光蛋白(EGFP)和荧光素酶(Luc)报告基因插入复制子载体pCMW-2M。p2MEGFP转染BHK-21细胞24小时后开始观察EGFP的表达。阳性细胞的形状、大小同对照BHK-21细胞没有差别,同时也没有观察到细胞病变效应。EGFP阳性细胞在转染后24小时很少,在转染后72小时明显。与观察EGFP表达类似,荧光素酶基因的表达在转染后7天仍然能够检测到,荧光素酶信号在转染后24小时到96小时呈指数增长。这些结果表明了插入了外源基因的JEV复制子能够有效地表达外源基因。我们通过免疫小鼠来研究JEV复制子pCMW-2M和pCMW-G2R的免疫原性。按每只小鼠50μg质粒pCMW-2M剂量肌肉注射6周龄的雌BALB/c小鼠,3次免疫后诱导的抗JEV的抗体滴度为1:1270、中和抗体滴度为1:3(250%噬斑减少实验),略高于pCMW-G2R组。pCMW-2M组的T淋巴细胞刺激指数(SI)为2.8,略高于pCMW-G2R组。这些结果证明了构建的JEV复制子载体pCMW-2M及pCMW-G2R在小鼠体内可以诱导针对JEV的体液免疫和细胞免疫。另外,pCMW-2M及pCMW-G2R免疫小鼠血清对JEV病毒攻击具有较好的保护作用,可达到约70%存活。炭疽杆菌(Bacillus anthracis)是一种能形成芽胞的革兰氏阳性菌,由它感染引起的炭疽病是严重危害人类的一种致死性的重大传染病,同时它又是一种潜在的生物战剂和生物恐怖试剂。PA是当前应用的疫苗主要成分,是引起机体免疫应答的最有效的免疫原。为了发展安全、有效的炭疽疫苗,DNA疫苗是一个重要方向。我们将PA抗原的第四结构域基因插入到JEV复制子pCMW-2M,这个插入了PA4基因的JEV复制子以DNA形式免疫小鼠后诱导了良好的体液免疫和细胞免疫反应,免疫3次后抗体滴度达到1:36200,T淋巴细胞刺激指数为2.6,这是国内外首次对构建表达炭疽PA的JEV复制型DNA载体进行的初步探索。另外,我们还表达并纯化了黄热病毒YFV囊膜蛋白(E蛋白)结构域Ⅲ,研究其作为亚单位疫苗预防YFV、JEV感染的可能性。YFDⅢ蛋白在大肠杆菌高效可溶性表达,表达量约占菌体蛋白的50%。纯化的YFDⅢ蛋白免疫新西兰兔和BALB/C鼠。Western Blot分析及ELISA表明纯化后的表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。利用纯化的YFDⅢ蛋白免疫新西兰兔,获得了高达1:4×105滴度的抗YFV抗体和1:2×104滴度的抗JEV抗体;利用纯化的YFDⅢ蛋白免疫BALB/C鼠,获得了1:7×104滴度的抗YFV抗体和1:2×103滴度的抗JEV抗体。表明能产生对抗YFV和JEV的抗体,抗原性及免疫原性较好。同时抗YFV免疫血清对乳鼠YFV攻毒的保护作用实验结果表明YFDⅢ蛋白免疫小鼠血清对YFV病毒攻击有较好的保护作用,这些结果提示YFDⅢ蛋白有可能具有开发研制成亚单位疫苗的潜能,这是国内外首次利用大肠杆菌高效可溶性表达了YFDⅢ蛋白并证明其具有较好的免疫原性和保护效力。综上所述,我们成功构建了新型JEV复制子载体,进行了国内外首次基于JEV减毒活疫苗株SA14-14-2的复制子载体的构建、表达自身和外源蛋白能力、免疫原性等方面的系统研究,证明JEV复制子具有作为递送外源基因的良好载体的潜力,为研究JEV的结构蛋白与非结构蛋白在病毒复制、包装中的作用积累了重要资料,为进一步研究JEV非结构蛋白(主要是NS1蛋白)的免疫原性及保护效力提供了帮助,为研制新型表达炭疽PA的JEV复制型DNA载体甚至双价或多价复制型DNA载体奠定了基础,同时也为利用JEV复制子载体作为疫苗载体进一步研制其它新型DNA疫苗建立了一个有价值的技术平台。