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一、研究背景与目的芥子气（sulfur mustard,SM）是难防难治型化学战剂的典型代表。自第一次世界大战以来,其被多次使用并造成大量人员伤亡。由于具有特殊的物理化学性质,如挥发性强,易于合成、储存和部署,芥子气是近几十年以来化学恐怖袭击中使用最频繁的毒剂之一。因此,当前芥子气中毒的防治工作是全球公共安全领域关注的焦点之一,也是全球反化学恐怖的主要对象之一,深入探索芥子气的毒理作用机制并开发高效的预防和治疗药物,具有重要的意义。作为一种强效的双功能烷基化起疱剂,芥子气可与全身组织的细胞内和细胞外成分发生烷基化反应,因此可导致全身系统性损伤,并最终导致死亡。肺损伤在芥子气中毒中是最常见的损伤及死亡的主要原因之一。研究发现,在芥子气发挥细胞毒性作用中,氧化应激和细胞凋亡是非常关键的过程。本课题组前期已经证实了骨髓间充质间质细胞来源的外泌体（BMSCs-Ex）在促进肺泡上皮屏障修复、减轻肺损伤方面作用显著。然而,BMSCs-Ex发挥治疗作用的关键功能组分和作用机制尚未得到充分阐述。考虑到人类脐带间充质干细胞（HMSCs）具有来源丰富、对供体无影响、易于收集、无同种异体排斥反应、避免伦理争议等优点,是细胞疗法治疗各种疾病的理想选择。因此,基于BMSCs-Ex和HMSCs的疗效作用,本文拟进一步探索人脐带间充质干细胞来源的外泌体（HMSCs-Ex）在改善芥子气肺损伤中的作用与机制。二、研究方法第一部分:HMSCs-Ex改善芥子气急性肺损伤的效应研究1.HMSCs-Ex的制备和鉴定。根据HMSCs表面特异性标志抗原特点及诱导分化特性,运用流式细胞术和诱导分化实验对分离培养获得的细胞进行鉴定。采用超速离心法从HMSCs培养上清中分离外泌体,通过使用透射镜观察外泌体的形态、纳米颗粒跟踪分析仪测量囊泡直径分布、免疫印迹检测外泌体的标志分子等方法进行鉴定。2.构建芥子气染毒动物模型,尾静脉注射HMSCs-Ex后观察并记录小鼠14天的生存率、体重变化情况,评估HMSCs-Ex的治疗效果。3.比较观察肺组织的病理切片、检测肺湿/干重比（W/D）和肺泡灌洗液（BALF）中的蛋白浓度（TP）变化,分析HMSCs-Ex对芥子气急性肺损伤的治疗作用。4.考虑到氧化应激和细胞凋亡在芥子气毒性发挥中的关键作用,在动物水平和细胞水平上探究HMSCs-Ex在抑制芥子气染毒后肺组织氧化应激损伤和凋亡方面的效应。用二氢乙锭（DHE）染色法测定小鼠肺组织中活性氧含量（ROS）,通过检测8-羟基脱氧鸟苷（8-OHd G）含量测定肺组织DNA氧化损伤程度;检测肺组织和BEAS-2B细胞丙二醛（MDA）含量测定脂质过氧化损伤程度;检测还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值GSH/GSSG和超氧化物歧化酶（SOD）活性水平测定肺组织和BEAS-2B细胞内源性抗氧化酶的产生情况。第二部分:miR-199a-5p在HMSCs-Ex改善芥子气急性肺损伤中的机制研究1.通过RT-q PCR及Western Blot实验检测SM暴露的BEAS-2B细胞在不同处理后的NRF2、HO1和NQO1 m RNA和蛋白水平表达变化,以探究HMSCs-Ex在减轻芥子气氧化应激损伤和抑制凋亡中可能的分子作用机制。2.根据HMSCs-Ex中的micro RNA（miRNA）数据信息选取10个最丰富的miRNA分子,通过细胞活力实验筛选HMSCs-Ex中发挥抑制氧化应激作用的潜在活性成分。通过RT-q PCR对各组细胞中相关miRNA的表达水平进行了初步验证。3.通过在HMSCs-Ex中过表达miR-199a-5p来构建miR-199a-HMSCs-Ex模型,采用RT-q PCR和Western Blot检测miR-199a-HMSCs-Ex处理后BEAS-2B细胞氧化应激相关指标及细胞凋亡指标的变化,以及NRF2、HO1和NQO1 m RNA和蛋白水平表达变化,以探究HMSCs-Ex中的miR-199a-5p可能发挥的作用。4.考虑到miRNA主要是通过与信使RNA（m RNA）结合,在转录或转录后水平下调靶基因表达来发挥生物学效应,因此对来源于HMSCs-Ex的miR-199a-5p的潜在的作用靶点进行研究。应用生物信息学预测、双荧光素酶报告基因实验,初步寻找miR-199a-5p的作用靶点;运用RT-q PCR及Western Blot检测SM暴露后不同给药处理后BEAS-2B细胞中作用靶点的m RNA和蛋白表达水平变化来验证miR-199a-5p与作用靶点的靶向关系。对miR-199a-5p的作用靶点小窝蛋白Caveolin1（CAV1）的生物学功能开展初步的研究。运用RT-q PCR、Western Blot、免疫荧光染色实验检测miR-199a-HMSCs-Ex处理后CAV1、NRF2、HO1和NQO1 m RNA和蛋白水平表达变化,以探索HMSCs-Ex中miR-199a-5p在抑制CAV1的表达、激活NRF2信号通路中发挥的作用。构建CAV1过表达的BEAS-2B细胞系,比较miR-199a-HMSCs-Ex处理对CAV1和NRF2信号通路蛋白表达的影响,以进一步阐明CAV1分子和miR-199a-5p在NRF2信号通路激活之间的关系。5.在动物水平上运用RT-q PCR、H＆E染色、免疫组化染色、Western Blot验证外泌体中miR-199a-5p在芥子气染毒肺损伤中的保护机制。三、研究结果第一部分:HMSCs-Ex改善芥子气急性肺损伤的效应研究1.所培养的人类脐带间充质干细胞（HMSCs）具有成脂、成骨、成软骨潜能,确定为未分化的间充质干细胞,超速分离得到的HMSCs-Ex纯度较高,后续实验可采用此方法制备的HMSCs-Ex。2.HMSCs-Ex治疗可以改善芥子气引发的小鼠存活率的下降,缓解小鼠腹泻症状、体重下降等芥子气染毒效应,且效果优于目前常用的芥子气抗氧化治疗药物N-乙酰半胱氨酸（NAC）（P?0.05）。HMSCs-Ex的同型对照外泌体人肺成纤维细胞来源的外泌体（HFLs-Ex）对生存率无明显改善作用（P＞0.05）。3.在动物水平上,HMSCs-Ex治疗可降低肺泡毛细血管通透性,抑制炎症细胞迁移,对SM所致肺损伤有明显的改善作用（P?0.001）。4.HMSCs-Ex能通过降低ROS、脂质过氧化产物（MDA）、升高抗氧化酶含量（SOD、GSH）等方式减轻芥子气染毒造成的小鼠体内氧化应激反应,从而抑制细胞凋亡并促进肺部损伤的修复。在细胞水平上,得到了与动物实验相一致的结果（P值皆小于0.05,有些小于0.01）。第二部分:miR-199a-5p在HMSCs-Ex改善芥子气急性肺损伤中的机制研究1.HMSCs-Ex可通过调控NRF2蛋白的入核及其下游抗氧化酶HO1、NQO1的表达增加来发挥抑制SM诱导的氧化应激和细胞凋亡的作用。2.细胞活力实验和RT-q PCR检测发现,miR-199a-5p可能是HMSCs-Ex在抑制SM诱导的氧化应激和细胞凋亡中发挥重要作用的关键外泌体组分。3.成功构建miR-199a-5p过表达的miR-199a-HMSCs-Ex模型后,发现miR-199a-5p在HMSCs-Ex中通过激活NRF2信号通路,发挥降低氧化反应和抑制细胞凋亡,改善芥子气肺损伤作用。4.生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验发现了miR-199a-5p与CAV1的靶向关系,RT-q PCR及Western Blot提示miR-199a-5p能在m RNA水平和蛋白质水平下调CAV1的表达,从而进一步验证了miR-199a-5p与CAV1的靶向关系。RTq PCR、Western Blot、免疫荧光染色实验发现在HMSCs-Ex中过表达miR-199a-5p有助于进一步抑制CAV1的表达,激活NRF2信号通路。CAV1在miR-199a-HMSCs-Ex介导的保护BEAS-2B中起到负调控NRF2信号通路的关键作用。5.动物实验验证发现,与HMSCs-Ex处理相比,过表达miR-199a-5p的HMSCsEx对芥子气中毒小鼠肺损伤有更加明显的改善作用（P?0.05）,而miR-199a-5p通过与CAV1的靶向结合从而促进NRF2信号通路的激活,因此降低了芥子气染毒肺损伤后的氧化性损伤和细胞凋亡。四、结论本研究首次将HMSCs-Ex用于治疗芥子气中毒,发现HMSCs-Ex能有效提高SM暴露小鼠的存活率,并在体外和体内表现出更好的抗氧化、抗凋亡能力,从而减缓肺损伤;进一步分析发现,HMSCs-Ex中含量丰富的核酸成分miR-199a-5p通过激活NRF2信号通路发挥抑制氧化应激和细胞凋亡的重要作用。此外,靶基因分析证实,CAV1是miR-199a-5p发挥调控作用的关键对象,miR-199a-5p通过靶向CAV1后,促进NRF2分子的表达以及抗氧化信号通路的激活。综上,本研究结果表明miR-199a-5p是HMSCs-Ex发挥作用的关键分子,通过调节CAV1/NRF2信号通路来抑制芥子气诱发的肺上皮细胞氧化应激和凋亡,从而减轻肺损伤。