产高温蛋白酶菌株的筛选及蛋白酶基因的克隆与表达研究

来源 :石河子大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:LXM302
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从新疆吐鲁番地区土样中分离筛选获得176株菌株,进行产酶功能筛选,获得一株产高温蛋白酶菌株,生理生化性质和16SrRNA初步鉴定为特基拉芽孢杆菌,将其命名为BacillustequilensisC9。对该菌株所产蛋白酶进行酶学特性的研究表明,菌株C9所产蛋白酶的最适作用温度是55℃,80℃处理30min后,该酶仍保留1%的酶活,最适作用pH是9.0,该酶的热稳定性和pH稳定性较好;不同的金属离子处理后,Fe2+具有激活作用。对该菌株进行摇瓶发酵产酶条件的优化,结果表明,影响该菌株产酶的主要因素是葡萄糖含量、装液量和接种量。在PB试验筛选获得主效应因子后,通过响应面分析方法对其产酶条件进行优化,进行方差分析和回归分析,建立了二次回归方程模型,获得该菌株的最优发酵产酶条件为:葡萄糖含量1.3%,装液量45ml,接种量5%,在此条件下其酶活为86.17U/ml,与未优化时相比酶活提高了2.1倍。采用PCR技术克隆获得蛋白酶基因apr,利用生物信息学工具进行序列分析,构建pET-28a-apr原核表达载体,转化BL21大肠杆菌,37℃下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活。测序结果表明,该蛋白酶基因apr全长1098bp,与BacillussubtilisaprE(AB734697)有98%的同源性,编码含有299个氨基酸残基的成熟蛋白,是易溶、亲水性较强的蛋白,属于Peptidases_S8_S53superfamily蛋白家族,融合蛋白分子量约为29kDa,蛋白酶酶活为28.4u/mL。运用包涵体蛋白纯化试剂盒纯化该蛋白,进行动力学研究表明,在以干酪素为底物,pH7.2温度45℃条件下,芽孢杆菌BacillustequilensisC9蛋白酶的Vmax为130.12umol/L﹒min,Km为0.655g/L。通过自然界分离选育的微生物菌群,由于突变率低,突变幅度小,很难获得高产菌株,利用诱发突变处理是最为可靠的微生物菌种选育方法。本研究采用紫外与NTG复合诱变育种,获得一株高酶活菌株N-12,与原始出发菌株相比,其酶活提高12.68%。
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