【摘 要】
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CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)系统是原核生物中形成的一种能够抵御噬菌体和外来核酸入侵的防御系统,通过对生物体基因组进行序列特异性的识别,从而实现对入侵生物体遗传物质的干扰、沉默及降解。CRISPR-Cas系统具有丰富的多样性,可以
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CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated proteins)系统是原核生物中形成的一种能够抵御噬菌体和外来核酸入侵的防御系统,通过对生物体基因组进行序列特异性的识别,从而实现对入侵生物体遗传物质的干扰、沉默及降解。CRISPR-Cas系统具有丰富的多样性,可以根据不同特征的Cas效应蛋白将其分成两个大类。第一大类CRISPR-Cas系统(包括I型,III型和IV型)通过多个Cas效应蛋白与crRNA形成功能复合物。第二大类CRISPR-Cas系统(包括II型,V型和VI型)是单个Cas效应蛋白与crRNA形成功能复合物;其中,II型和V型系统的Cas效应蛋白,如Cas9,Cas12a(Cpf1)和Cas12b(C2c1),已被设计成强大的基因编辑工具。新鉴定的第二大类VI型CRISPR-Cas13b系统具有crRNA介导的RNase活性,已经被成功改造并应用于RNA编辑与检测工作。为了研究清楚Cas13b如何加工pre-crRNA,识别并介导成熟的crRNA对靶RNA进行切割,需要解析结构获得信息,本研究解析了Bergeyella zoohelcum Cas13b(BzCas13b)与crRNA二元复合物的晶体结构。BzCas13b的整体结构呈现三角形,成熟的crRNA以L型构象结合在BzCas13b蛋白内部的带大量正电荷的中央孔道内。crRNA的repeat region具有扭曲的A型RNA双螺旋结构,并被包裹在由Helical-2、两个RRI结构域及linker region形成的口袋内。crRNA的spacer region的一侧与Helical-1、HEPN-1、RRI-1和RRI-2结构域相互作用,其另一侧与Helical-2结构域相互作用。根据二元复合物的结构及体外生化功能实验,发现BzCas13b对pre-crRNA的加工位点在repeat region的3’端下游spacer region的核苷酸A(-37)和其下游紧邻的核苷酸之间,且BzCas13b的RRI-2结构域的K452与R459氨基酸残基对于pre-crRNA加工至关重要。BzCas13b两个HEPN结构域上的R116A或R1177A突变可以破坏靶RNA切割活性。结构分析表明,BzCas13b具有两个独立的RNase活性中心,一个行使pre-crRNA加工的功能,位于RRI-2结构域;另一个行使靶RNA切割的功能,位于HEPN结构域。然而,在二元复合物中,两个HEPN结构域的催化残基间距较远,BzCas13b尚不处于被充分激活的构象。本论文揭示了BzCas13b加工pre-crRNA的酶活性中心以及crRNA的识别模式,为CRISPR-Cas13b系统的理性改造与进一步应用提供了理论基础。
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