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目的:(1)从成骨细胞(Osteoblast,OB)/破骨细胞(Osteoclast,OC)维持的骨重塑平衡体系阐明激素性骨坏死(Steroid-Induced Osteonecrosis,SION)的病理特征及其修复机制;(2)筛选出具有增强OB活性和(或)抑制OC分化作用的龙血竭提取物;(3)从分子生物学角度阐明上述药物与已知OB、OC分化相关信号通路中基因和蛋白的作用关系,明确其促进SION坏死骨修复的作用机制;(4)在动物疾病模型上明确上述药物对SION大鼠股骨头内坏死骨修复的作用,阐述药物与上述信号通路中基因和蛋白的作用关系。方法:(1)第一部分:纳入“围塌陷期”激素性股骨头坏死(Steroid-Induced Osteonecrosis of femoral head,SIONFH)人体股骨头标本,应用影像学及H&E染色等技术,对比观察大体标本不同病变区域骨组织的病理学表现,并检测骨组织中与OB、OC分化相关的基因转录表达情况。即从OB/OC体系角度阐述SION的病理特点,明确其修复机制。(2)第二部分:体外分离、纯化OB和OC原代细胞,分别以相同浓度的龙血竭提取物干预其分化过程,应用碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色技术筛选出具有增强OB矿化功能的药物,应用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcP)染色、肌动蛋白环染色、骨吸收实验等技术筛选出具有抑制OC分化作用的药物。优化药物浓度梯度,应用普通荧光染色、免疫荧光染色、Western blot、RT-qPCR等技术,检测OB或OC分化相关信号通路中基因和蛋白的表达情况。即从细胞层面确定上述药物的分子作用机制。(3)第三部分:建立Sprague Dawley大鼠SION疾病模型,采用上述有效药物及生理盐水分别干预动物模型,应用H&E染色、micro-CT扫描等骨组织形态计量学技术,对比分析药物组大鼠股骨头内坏死骨的修复情况,并应用普通荧光成像、Western blot、RT-qPCR等技术检测股骨头骨组织内OB、OC相关信号通路中基因和蛋白的表达情况。即从疾病动物模型角度阐述药物促进SION坏死骨修复的调控机制。结果:(1)SIONFH人体标本在大体切片和X线片上呈现出的正常区、坏死区以及修复区与镜下病理改变相一致。坏死区骨组织骨量严重丢失,而且骨组织中与0C分化相关的RANKL、NFATc1以及CTSK蛋白表达升高,与OB分化相关的Runx2蛋白表达下降;相反,修复区骨组织中OC分化相关蛋白受到抑制,而Runx2蛋白高度表达。(2)龙血竭六种查尔酮类提取物对OB的矿化过程没有明显影响,但均可在一定程度上抑制OC的形成,其中龙血素B(LrB)的抑制作用最强。LrB可通过p38/MAPK、JNK/MAPK信号通路以及钙离子信号通路抑制NFATc1 的表达,同时通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路抑制活性氧(ROS)的活性,以抑制OC的形成和骨吸收功能。(3)LrB可显著抑制ROS活性,抑制SION大鼠股骨头内OC数量,降低与OC骨吸收功能相关的CTSK蛋白的表达,促进与OB骨形成功能相关TNFRSF11B基因的表达,并有效增加股骨头内松质骨骨量,从而促进SION坏死骨的修复。结论:龙血竭提取物(龙血素B)可通过调控OB/OC维持的骨重塑体系,促进SION坏死骨的修复。