脂肪性肝病是以甘油三酯在肝脏过度沉积为主要特点的临床病理综合征,在中国已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。根据病因,脂肪性肝病分为酒精性和非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)两大类,其中NAFLD发病率约占世界人口的24%,呈逐年增长并有低龄化的趋势。在无外界干预的条件下,NAFLD可以从单纯性脂肪变进展为脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化、肝硬化,最终导致肝癌的发生,未来可能成为肝脏移植和肝癌发生的首要原因,严重威胁人类的健康,目前尚无有效的治疗措施。因此,阐明NAFLD的发生机制,寻找新的干预靶点对于预防和治疗NAFLD具有重要意义。NAFLD致病机制复杂,以脂质过量储积和过度炎症为典型特征,肝实质细胞脂质代谢失调、免疫细胞过度分泌炎性细胞因子共同促进NAFLD的进展。越来越多的研究表明,肝脏中数目庞大的肝实质细胞(在肝脏细胞中占比最大,约60%)和肝巨噬细胞(在肝脏免疫细胞中数量最多,约占肝脏细胞的15%)在NAFLD的进展中发挥重要作用。因此,发现肝脏中炎症反应和脂质代谢的调节分子将为预防和治疗NAFLD提供新的免疫靶点,具有重要的理论研究价值和潜在的临床应用前景。T 细胞免疫球蛋白及粘蛋白-4(T cell immunoglobulin mucin domain protein-4,Tim-4)作为Tim-1的天然配体,在免疫调节及维持机体稳态中具有重要作用。Tim-4属于I型跨膜糖蛋白,其分子结构包括免疫球蛋白V(Immunoglobulin V,IgV)结构域、黏蛋白(Mucin)结构域、跨膜区和胞内区。Tim-4选择性高表达于抗原递呈细胞,尤其高表达于活化的巨噬细胞和成熟的树突状细胞,同时在B1、iNKT细胞上也有表达,但不表达于T细胞。其次,Tim-4作为磷酯酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)的受体,通过IgV结构域的PS结合位点FG-CC’口袋识别凋亡细胞膜外翻的PS,从而介导巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬,进而维持机体免疫稳态。近年来,研究证实,在ConA诱导的肝炎、LPS诱导的脓毒症等多种炎症相关性疾病中,Tim-4可以通过负调控巨噬细胞,减轻炎症损伤,并且在2 型糖尿病中,外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcells,PBMCs)中Tim-4表达与血清IL-1β、IL-18水平呈负相关,以上结果提示,巨噬细胞Tim-4可能是一种治疗炎症性相关疾病的潜在靶标。文献报道,Tim-4的多个SNPs位点与脂代谢指标-甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)等相关,并且全基因组关联(GWAS)研究结果显示,大鼠给予高脂饮食(High-fat diet,HFD)4周后,肝组织中Tim-4 mRNA的表达水平升高、而腹膜下脂肪组织中Tim-4 mRNA的表达降低,然而,Tim-4在NAFLD发生、发展中的具体作用,迄今尚未见相关文献报道。综上,本论文旨在研究Tim-4在NAFLD中的作用,并探讨其相关机制,进一步阐明Tim-4新型生物学功能,解析NAFLD发生的新机制,期望为NAFLD或炎症性、代谢紊乱相关肝脏疾病的诊断、治疗提供新靶点。根据研究目的,本论文分为三部分,主要解决以下三个问题:(1)Tim-4在NAFLD中的作用如何?(2)NAFLD微环境对Tim-4的表达有何影响?(3)Tim-4是否可以调控巨噬细胞功能,进而调节炎性细胞因子分泌并参与NAFLD的进展?第一部分Tim-4在NAFLD中的作用为了明确Tim-4与NAFLD的相关性,首先收集健康人和NAFLD患者的外周血、伴有脂肪变的肝癌癌旁组织,并利用肝癌组织芯片,检测Tim-4的表达变化,随后在 HFD 和胆碱、蛋氨酸缺乏(Methionine-and choline-deficient,MCD)饮食诱导的两种NAFLD小鼠模型中,进一步确认NAFLD肝组织中Tim-4的表达水平。为了进一步明确肝组织中高表达的Tim-4在NAFLD中发挥的作用,随后对Tim-4敲除(Tim-4-/-)小鼠和野生型(Tim-4+/+)小鼠进行MCD饮食诱导NAFLD模型,通过检测脂质沉积和肝脏炎症的相关指标,明确Tim-4在NAFLD发生中的具体作用。1.1 Tim-4在NAFLD患者的血浆、PBMCs及人脂肪变肝组织中的表达1.1.1 NAFLD 患者血浆中分泌型 Tim-4(Secretory Tim-4,sTim-4)的水平升高为了明确Tim-4与NAFLD的相关性,收集了117例NAFLD患者和60例健康人的血浆,使用ELISA检测sTim-4的差异。结果显示,与健康人相比,NAFLD患者的血浆中sTim-4水平显著升高。1.1.2 NAFLD患者PBMCs中Tim-4 mRNA的表达下调随后收集68例NAFLD患者和44例健康人的抗凝外周血,Ficoll法分离外周血 PBMCs,实时定量 PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测 PBMCs上Tim-4 mRNA的表达。结果显示,Tim-4在NAFLD患者PBMCs中的表达下降。1.1.3人脂肪变肝组织中Tim-4的表达升高对肝癌组织芯片进行组化染色,对所有肝癌癌旁组织结果进行分析。免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)结果表明,与非脂肪变的肝癌癌旁组织相比,伴有脂肪变的肝癌癌旁组织中Tim-4表达升高。进一步进行免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色,结果证实,与非脂肪变的肝组织相比,伴有脂肪变性的肝组织中Tim-4的表达升高。1.2 Tim-4在NAFLD小鼠肝组织中的表达上调为了进一步验证Tim-4在NAFLD肝组织中的表达水平,利用C57BL/6小鼠分别进行两种不同饮食诱导构建NAFLD小鼠模型,包括HFD饮食诱导6个月和MCD饮食诱导2周。与正常饮食(Normal diet,ND)的小鼠相比,通过体重变化、肝脏组织进行苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色和油红O染色(Oil red O,ORO),结果显示HFD和MCD饮食的小鼠肝组织中炎性细胞浸润、空泡化和脂质沉积增多,同时伴有肝匀浆上清中代谢指标TG、胆固醇(Cholesterol,CHO)、LDL以及血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)的水平升高,表明NAFLD小鼠模型构建成功。利用NAFLD小鼠模型及其正常饮食的对照小鼠,通过蛋白质印记(Western blot,WB)、qPCR、IHC、IF等多种方法检测Tim-4在肝组织中的表达水平。结果显示,与ND小鼠相比,HFD、MCD饮食诱导的NAFLD小鼠肝组织中Tim-4的表达均显著升高。以上结果提示,Tim-4在NAFLD肝组织中的表达上调,可能参与调控NAFLD的进展。1.3 Tim-4敲除加重MCD诱导的NAFLD为了明确NAFLD小鼠肝组织中高表达的Tim-4在NAFLD进展中的作用,我们对Tim-4+/+和Tim-4-/-小鼠进行了 MCD饮食,通过监测体重变化,肝脏HE、ORO 染色、ALT、AST、肝匀浆上清中 TG、LDL、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6等多种表征肝脏脂肪变和炎症的指标,均表明,与Tim-4+/+小鼠相比,Tim-4-/-小鼠肝脏中脂质沉积增多、炎症加重。由此推测,在NAFLD小鼠中,肝组织中高表达的Tim-4可能通过某种保护机制抑制脂肪肝的进展。第二部分NAFLD微环境诱导Tim-4在肝脏免疫细胞及实质细胞中的表达NAFLD是一种在无过量饮酒史的条件下,以肝实质细胞内大泡性或散在小泡性脂肪变性、炎性细胞浸润增加为主要病理特征的肝脏疾病,其中,肝实质细胞中脂质代谢异常、肝脏居留巨噬细胞-枯否细胞(Kupffercells,KCs)活化导致的炎症增加是NAFLD最直观的表现。KCs作为肝脏中的一群固有免疫细胞,占人体所有居留巨噬细胞的80-90%,含量丰富,对于调节肝脏固有免疫应答比较重要。在正常生理状况下,KCs倾向于抗炎的M2型巨噬细胞,通过其清道夫受体清除凋亡细胞、Toll样受体诱导T细胞活化等维持肝脏稳态平衡。而在饮食诱导的NAFLD小鼠模型中,KCs倾向于促炎的M1型巨噬细胞,LPS、活性氧、饱和脂肪酸和胆固醇结晶等均可以活化巨噬细胞,主要激活下游NF-κB和JNK通路,其活化后上调IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β和TNF相关凋亡诱导配体表达,促进CCL2、CCL3-5、CCL7和CCL8等趋化因子的合成与分泌,导致大量的单核细胞浸润和肝细胞焦亡,加重NAFLD的进展。而清除巨噬细胞后,可以减轻NAFLD的症状。以上研究证实,巨噬细胞的活化可以加重NAFLD,在NAFLD向NASH转变的进程中发挥重要作用,提示巨噬细胞调控因子可能参与NAFLD发生、进展的多个环节。Tim-4不仅组成性高表达于巨噬细胞,实验室前期利用LPS刺激RAW264.7细胞系、骨髓来源的巨噬细胞(Bonemarrow-derived macrophages,BMDMs)及IFN-y刺激小鼠腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophages,PEMs)等,发现多种因素均可上调Tim-4在巨噬细胞中的表达。文献显示,肿瘤化疗后产生的危险相关分子模式也可上调肿瘤相关巨噬细胞中Tim-4的表达。因此,推测NAFLD微环境中的众多炎症因子是否可以进一步诱导Tim-4在肝脏巨噬细胞的表达上调?另外,肝实质细胞,作为肝脏细胞中占比最大(体积:80%;数量:60%)的一类上皮来源细胞,负责执行肝脏大部分功能,如糖、脂、蛋白质、维生素的代谢、重要蛋白的合成、解毒、分泌胆汁等。在NAFLD微环境下,肝实质细胞内的脂质代谢平衡不仅发生紊乱,而且肝实质细胞的脂质代谢稳态也受巨噬细胞的调节。文献报道,巨噬细胞活化分泌的IL-1β可以促进肝实质细胞TG合成,抑制脂肪酸氧化,间接调节肝细胞中脂质代谢。实验室前期发现,肿瘤微环境可诱导Tim-4异位表达于非小细胞肺癌细胞,现已报道,Tim-4可异位表达于结肠癌等多种肿瘤细胞,那么,在NAFLD微环境下,Tim-4是否可异位表达于肝实质细胞尚未见报道。2.1 Tim-4在NAFLD小鼠肝组织NK、NKT细胞的表达为了明确Tim-4在免疫细胞中的表达情况,利用ND和HFD饮食小鼠的肝组织分离肝单个核细胞,通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测Tim-4在ND和HFD饮食诱导的小鼠肝脏CD3-NK1.1+CD49a+DX5-NK细胞和CD3+NK1.1+NKT细胞中的表达变化。结果显示,与ND组小鼠相比,Tim-4在HFD饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏NK和NKT中的表达均没有显著差异,并且在NK和NKT细胞中的表达比较低。2.2 NAFLD小鼠及人脂肪变肝组织巨噬细胞中Tim-4的表达上调为了明确Tim-4在肝脏巨噬细胞中的表达水平,我们检测了Tim-4在NAFLD小鼠和人脂肪变肝组织巨噬细胞中的表达情况。首先,分离ND/HFD和ND/MCD饮食诱导的小鼠肝单个核细胞,FCM检测结果显示,与Tim-4高表达于居留巨噬细胞的文献报道相一致,Tim-4在肝脏巨噬细胞上的表达水平较高,另外发现,Tim-4在HFD及MCD小鼠的CD11b+F4/80+巨噬细胞中的表达水平显著高于ND小鼠;进一步利用瘦素受体缺陷(db/db)自发性脂肪小鼠模型进行验证,FCM检测结果也表明Tim-4在伴有脂肪变的db/db小鼠肝脏CD11b+F4/80+巨噬细胞中的表达显著高于对照db/m小鼠。IF检测结果显示,在NAFLD小鼠的肝组织中,CD68和Tim-4的共定位及Tim-4+/CD68+巨噬细胞的比例增多。进一步利用人肝癌癌旁组织进行IF检测,发现伴有脂肪变的肝组织中Tim-4+/CD68+巨噬细胞的比例显著增加。2.3 NAFLD微环境上调巨噬细胞中Tim-4的表达为了体外模拟NAFLD微环境,制备NAFLD小鼠的肝组织匀浆上清(Liver homogenate supernatants,LHSs),利用 LHSs 分别刺激肝 KCs、PEMs 和 BMDMs,通过多种方法检测NAFLD微环境对Tim-4在巨噬细胞中表达的影响。FCM、qPCR和WB结果显示,与ND小鼠来源的肝匀浆上清相比,无论是用HFD还是MCD小鼠来源的LHSs刺激,Tim-4在巨噬细胞中的表达均显著升高。进一步使用小分子脂质代谢物-不饱和脂肪酸油酸(Oleic acid,OA)刺激PEMs后,通过WB和qPCR方法检测,结果均显示,与对照组相比,OA刺激后,Tim-4在巨噬细胞中的表达升高。综上,体内与体外结果均证实,NAFLD微环境可显著上调巨噬细胞中Tim-4的表达,推测Tim-4可能通过调节肝脏巨噬细胞的功能参与NAFLD的进展。2.4 NAFLD小鼠及人脂肪变肝组织肝实质细胞中Tim-4的表达上调随后,我们又检测了 Tim-4在NAFLD肝实质细胞中的表达情况。首先提取小鼠肝实质细胞,通过WB和qPCR检测,发现Tim-4在HFD饮食诱导的NAFLD小鼠肝实质细胞中的表达高于ND小鼠。随后通过IF检测ND、HFD、MCD和db/db小鼠肝组织中细胞角蛋白18(Cytokeratin18,CK18,肝上皮细胞标记分子)和Tim-4的共表达,结果表明,在NAFLD模型小鼠肝组织中,Tim-4在CK18+肝细胞中的表达明显高于对照小鼠。与上述结果一致,临床标本检测显示,在伴有脂肪变的肝癌癌旁肝组织中,Tim-4在CK18+肝细胞中的表达明显高于无脂肪变的肝组织。2.5 NAFLD微环境上调肝细胞中Tim-4的表达为了模拟NAFLD的微环境,在体外利用细胞因子和脂类物质OA、OX-LDL刺激人的肝癌细胞系HepG2和HuH7细胞,结果表明,OA、OX-LDL刺激可上调Tim-4在肝癌细胞系中的表达。另外,使用HFD饮食诱导的NAFLD小鼠肝匀浆上清刺激小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6,qPCR检测显示Tim-4的表达上调。第三部分巨噬细胞Tim-4通过LKB1/AMPKα途径抑制NLRP3炎性小体实验室前期研究发现,Tim-4在2型糖尿病患者外周血PBMCs中的表达上调,并且其表达水平与IL-1β、IL-18水平呈负相关,而成熟IL-1β、IL-18的产生依赖于炎性小体的活化,提示Tim-4可能负调控炎性小体的活化。NLRP3炎性小体为目前研究最为清楚的一类炎性小体,而且NLRP3炎性小体活化在NAFLD发生、进展中发挥重要作用,本部分旨在探讨Tim-4对巨噬细胞NLRP3炎性小体的调控作用及相关机制。3.1 NAFLD小鼠肝组织中NLRP3炎性小体的活化首先,通过IF检测NLRP3与ASC在NAFLD小鼠模型肝组织的表达。结果显示,与ND小鼠相比,在HFD、MCD饮食诱导的NAFLD小鼠肝组织中,NLRP3与ASC的共定位增加。ELISA检测显示,NAFLD小鼠肝组织匀浆上清中IL-1β、IL-18水平显著升高,同时炎症因子TNF-α和IL-6的水平也升高,提示NAFLD进展过程中伴有NLRP3炎性小体的活化。文献报道,在NAFLD小鼠及NASH患者中,NLRP3炎性小体活化增加,该结果与此相一致。3.2 Tim-4敲除促进NAFLD小鼠NLRP3炎性体的活化为了明确在NAFLD中,高表达的Tim-4是否对巨噬细胞NLRP3炎性体发挥调控作用,在体外对Tim4+/+、Tim-4-/-来源的PEMs和BMDMs,特异性诱导NLRP3炎性小体活化,检测上清中分泌的IL-1β和IL-18水平。结果显示,敲除Tim-4后,PEMs和BMDMs细胞上清分泌更高水平的IL-1β和IL-18,表明Tim-4敲除可促进NLRP3炎性小体的活化。另外,分离肝脏KCs,过表达Tim-4后并诱导NLRP3炎性小体活化,结果显示,随着Tim-4转染剂量的增加,Caspase-1活化水平及细胞上清IL-1β的分泌逐渐降低,表明在过表达Tim-4后能够抑制NLRP3炎性小体的活化。随后,进一步利用HEK293细胞进行NLRP3炎性小体的重构,并共转染Tim-4或空载体对照,与KCs中的结果一致,随着Tim-4转染剂量的增加,Caspase-1活化水平及细胞上清IL-1β的分泌逐渐降低。以上结果共同表明,Tim-4可抑制巨噬细胞中NLRP3炎性小体的活化。3.3 Tim-4依赖其PS结合位点抑制NLRP3炎性小体的活性为了明确Tim-4抑制NLRP3炎性小体活化的关键结构域,分别构建了 Tim-4-免疫球蛋白V结构域(Immunoglobulin V domain,IgV)、Mucin、Cyto 结构域缺失的截短体(△IgV/Mucin/Cyto),在HEK293细胞进行NLRP3炎性小体重构的同时,分别转染Tim-4全长或不同结构域缺失的载体。结果显示,共转染△IgV后,Tim-4抑制NLRP3炎性小体活化的作用消失。进一步把IgV结构域中的两个功能性基序RGD基序和PS结合位点分别进行突变(Mut PS/RGD),结果显示,转染Mut PS后,Tim-4抑制NLRP3炎性小体活化的作用消失,而RGD突变则无明显影响。综上结果表明,Tim-4可能通过其IgV结构域的PS结合位点抑制巨噬细胞中NLRP3炎性小体的活化,使IL-1β和IL-18的分泌减少。3.4 Tim-4通过促进自噬抑制NLRP3炎性小体的活化为了进一步明确Tim-4抑制NLRP3炎性小体活化的机制,将Tim-4和NLRP3共转染HEK293细胞,检测其mRNA及蛋白水平的表达变化,发现随着Tim-4转染剂量的增加,NLRP3的蛋白水平逐渐降低,而转录水平无明显变化,推测Tim-4可能通过促进NLRP3蛋白降解,从而抑制NLRP3炎性小体活化。为了明确Tim-4促进NLRP3炎性小体蛋白降解的途径,在HEK293细胞转染NLRP3的同时过表达Tim-4,并分别加入蛋白酶体途径抑制剂MG-132、自噬通路上游分子PI3K class Ⅲ抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、自噬小体与溶酶体融合的抑制剂氯喹(chloroquine,CQ),结果显示,加入3-MA和CQ可以显著增加NLPR3蛋白的积累。另外,HEK293细胞中重构NLRP3炎性小体,过表达Tim-4可激活自噬通路,p62和NLRP3炎性小体相关成分的蛋白水平降低;CQ处理组,自噬溶酶体降解途径被阻断,自噬内容物p62和NLRP3炎性小体相关成分的蛋白水平积累;而在过表达Tim-4的同时加入CQ,不仅p62的降解被阻断,同时积累的NLRP3炎性小体的蛋白也会进一步增多。以上结果表明,Tim-4通过激活自噬促进NLRP3炎性小体蛋白成分的降解。3.5 Tim-4通过AMPKα途径激活自噬为了明确Tim-4激活自噬通路的机制,在HEK293及PEMs细胞中通过免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)试验检测Tim-4与自噬通路关键上游分子AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase α,AMPKα)的相互作用,结果表明,Tim-4能够与AMPKα结合。另外发现,HEK293细胞过表达Tim-4后,AMPKα的磷酸化(Thr172)水平增加,同时下游的自噬通路活化。然而,过表达△IgV或mut PS载体后,Tim-4促进自噬的作用消失。进一步在HEK293细胞加入外源性PS进行刺激,结果显示,Tim-4对AMPKα的磷酸化作用增强,而转染mut PS后,无论是否添加PS,Tim-4促进AMPKα磷酸化的作用均不存在。以上结果表明,PS结合位点在Tim-4促进AMPKα磷酸化、活化自噬通路中发挥关键作用。3.6 Tim-4通过其PS结合位点与LKB1互作,促进AMPKα磷酸化为了探究Tim-4促进AMPKα磷酸化的分子机制,在过表达Tim-4的同时,分别干扰调控AMPKα磷酸化的3个重要的激酶:CaMKKβ(Calcium(Ca2+)/calmodulin-depedent protein kinase kinase β)、TAK1(TGF-β-activated kinase-1)和 LKB1(Liver kinase B1)。结果显示,只有干扰 LKB1 时,Tim-4 促进 AMPKα磷酸化的作用消失,表明Tim-4通过LKB1促进AMPKα的磷酸化。进一步在HEK293细胞转染mut PS载体的同时并干扰LKB1,结果发现,无论干扰LKB1与否,Tim-4的PS结合位点突变后,均不能使AMPKα的磷酸化水平发生改变。IP结果显示,Tim-4可以与AMPKα、LKB1发生相互作用,而PS结合位点突变后,三者的结合减弱。以上结果表明,Tim-4通过其PS结合位点介导与AMPKα、LKB1的相互作用,促进LKB1对AMPKα的磷酸化。3.7 Tim-4、LKB1和AMPKα在NAFLD小鼠肝组织中的共定位使用Opal/TSA多色荧光免疫组化染色方法,检测Tim-4、AMPKα、LKB1三者在NAFLD小鼠模型肝组织中的共定位情况,结果表明,与ND组相比,HFD和MCD饮食诱导的NAFLD小鼠肝组织中,呈冠状聚集的巨噬细胞中Tim-4-AMPKα-LKB1三者共定位增多。综上,本研究利用人肝癌癌旁组织标本和NAFLD小鼠模型,首次明确了在NAFLD微环境下,肝脏巨噬细胞和肝实质细胞中Tim-4的表达均显著升高,而敲除Tim-4后,MCD诱导的脂肪肝和肝炎进一步加重。在肝脏巨噬细胞中,Tim-4通过其PS结合位点,与LKB1-AMPKα相互作用,促进AMPKα磷酸化,激活自噬通路,降解NLRP3炎性小体相关蛋白成分,从而抑制IL-1β和IL-18的进一步分泌,抑制肝脏炎症和NAFLD的发生发展,但NAFLD微环境诱导Tim-4表达的分子机制、肝实质细胞Tim-4在NAFLD中的具体作用及相关机制还有待于进一步深入研究。