研究背景目前,职业性尘肺病依然是我国最为严重的职业病,而矽肺是尘肺中最常见的类型。矽肺由长久暴露于含大量游离二氧化硅的粉尘所引起,以肺脏弥漫性结节性纤维化为特征,并呈进行性发展,最终严重损害肺功能,导致呼吸衰竭甚至死亡。近年来,由于工业化进程的发展,矽肺的发病率和流行率一直在上升,特别是在发展中国家。中国拥有最大的矽肺患者人群,每年全国因矽肺病导致的直接经济损失达80多亿,间接损失难以计数。在发达国家,矽肺同样也是一个备受瞩目的职业健康问题。但矽肺的发病机制目前尚不明确,且缺乏有效的治疗措施,因此,研究和探索矽肺的发病机制及新的防治方法十分必要。矽肺的发病与进展是一个多因素的复杂过程,其中包括二氧化硅引起的持续性肺部炎症和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积,最终导致正常肺组织结构的不可逆性破坏和肺纤维化。既往研究已经发现了许多矽肺的重要致病机制,其中氧化应激是调节多种生物过程和信号转导途径的重要分子机制。当机体吸入二氧化硅颗粒时,它们被肺泡巨噬细胞吞噬并持续存在,通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮的形成引起氧化应激反应。氧化应激可导致上皮细胞表型异常,包括激发细胞因子产生、促进上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和诱导上皮细胞凋亡,导致成纤维细胞的增殖和ECM在肺组织中的过度沉积,并进一步诱导细胞毒性、氧化应激和肺部炎症,最终导致矽肺的发生。在此过程中,许多细胞因子成分参与了对肺纤维化的正向或负向的调节,其中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是强有力的致纤维化的关键细胞因子。TGF-β1主要通过经典的TGF-β1/Smad信号途径对纤维化疾病中的细胞增殖、分化、迁移、免疫调节及ECM转变过程具有重要的调控功能。大量研究表明TGF-β1/Smad信号通路的失调是组织纤维化的重要致病机制,其作为一种有效的抗纤维化治疗靶点受到了越来越多的关注,因此,抑制TGF-β1/Smad信号通路可能是缓解矽肺肺纤维化的一种治疗策略。为了保持适当的氧化还原平衡,我们的机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统,包括一系列内源性抗氧化酶。肺损伤可同时导致TGF-β1和氧化应激水平的升高。越来越多的证据表明,ROS和氧化应激的产生与许多细胞因子和促纤维化生长因子的产生和激活有关。TGF-β1/Smad信号通路的激活是纤维化形成的主要驱动力,而氧化应激是与TGF-β1的促纤维化活性有关的重要有害促进因素。在整个纤维化过程中,TGF-β1与氧化应激信号之间有明显的相关性。TGF-β1可提高肺组织的ROS水平,ROS反过来刺激TGF-β1相关的成纤维细胞活化和肌成纤维细胞分化。研究发现与TGF-β1相关的纤维化事件与活性氧清除酶的降低和/或ROS产生酶的诱导生成增加有关。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidases,NOX)是内源性ROS产生的主要来源。其中NOX4具有独特的组成活性,作为细胞外ROS产生的主要酶源,NOX4衍生的ROS已被公认为氧化应激的主要来源。NOX4作为TGF-β1诱导的促纤维化反应的下游介质,诱导ROS的形成,并通过调节TGF-β1诱导的成纤维细胞活化、肌成纤维细胞分化参与了纤维化的发病机制。研究表明NOX4在纤维化疾病中上调,对肝、肾、肺和心脏纤维化的发病机制有重要贡献。NOX4被认为是肺纤维化与TGF-β1信号传导增强相关的潜在治疗靶点。核因子-红系 2 相关因子-2(nuclear factor erythroid 2-related factor-2,Nrf2)是一个重要的氧化还原敏感转录因子,参与宿主防御氧化应激。Nrf2在静止时与其抑制剂胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)结合,在组织损伤介导的ROS或亲电刺激下从Keap1释放,进入细胞核,激活抗氧化反应原件(antioxidantresponse element,ARE),诱导下游抗氧化剂和解毒酶的表达,包括血红素加氧酶-1(Hemeoxygenase-1,HO-1)和NADPH 醌氧化还原酶(NADPH quinone oxidoreductase,NQO-1)等,是维持细胞氧化还原稳态的必需因素。研究证明Nrf2参与了纤维化形成的动态过程,并似乎是组织纤维化的负调节因子。Nrf2不仅平衡氧化应激,而且对TGF-β1介导的纤维化促进信号转导有负调节作用。研究证明Nrf2似乎可发挥细胞自主抗纤维化的作用。在持续性的器官纤维化中,Nrf2激活受损,从而改变了 NOX4-Nrf2氧化还原平衡和导致肌成纤维细胞获得抗凋亡表型。Nrf2作为多种抗氧化、抗炎和抗纤维化通路的主调节器的证据使其具有作为治疗目标的潜在价值,Nrf2信号的激活可减轻肺损伤和肺纤维化的进展,提示靶向Nrf2/ARE信号通路的策略具有抗矽肺肺纤维化的潜能。天然产物在药物的研发中起着非常重要的作用。丹参酮ⅡA(Tanshinone ⅡA,Tan ⅡA)是中药丹参中最重要的有效活性成分,具有良好的生物利用度和多种药理效用,其在多种器官中被报道具有抗炎、抗氧化、抗纤维化等特性。然而,对丹参酮ⅡA治疗矽肺的疗效研究甚少,丹参酮ⅡA是否具有对矽肺的治疗作用,以及其分子作用机制仍然未知。它是否可以有效缓解矽肺的肺损伤及肺纤维化呢?研究目的1.研究丹参酮ⅡA腹腔注射对矽肺大鼠模型的治疗作用,从肺组织病理学、气道炎症细胞募集、肺组织炎症因子含量等方面观察丹参酮ⅡA对矽肺的保护和治疗作用。2.体内实验研究丹参酮ⅡA是否可抑制矽肺大鼠的TGF-β1/Smad信号通路;体外实验研究丹参酮ⅡA是否可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的上皮间充质转化(EMT)及TGF-β1/Smad信号通路的激活,从而减轻二氧化硅诱导的肺纤维化。3.体内及体外实验探讨丹参酮ⅡA是否能减轻二氧化硅导致的氧化应激,并通过抑制NOX4表达、激活Nrf2/ARE抗氧化应激信号通路来发挥对二氧化硅诱导的肺损伤及纤维化的保护作用。实验方法1.体内实验1.1动物造模及给药处理1)48只SD大鼠(年龄6～8周,体重200±20g)随机分为四组(每组12只):ⅰ)对照组;ⅱ)丹参酮ⅡA组;ⅲ)矽肺组;ⅳ)矽肺+丹参酮ⅢA组。气管插管法建立矽肺大鼠模型:SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后,矽肺组及矽肺+丹参酮ⅡA组大鼠气管内置入硬膜外麻醉导管,然后将1 ml二氧化硅粉尘悬浮液(50mg/ml)及0.25ml空气灌入气管。之后,立即旋转大鼠,使注射液均匀地分布在肺部。对照组及丹参酮ⅡA组气管插管法灌入等量生理盐水及空气。2)造模2天后,给予丹参酮ⅡA组和矽肺+丹参酮ⅡA组大鼠每日腹腔注射25 mg/kg体重的丹参酮ⅡA共40天,对照组和矽肺组大鼠同时每日腹腔注射等量无菌生理盐水。造模42天后,4组大鼠均收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),后麻醉处死获取肺组织。1.2观察丹参酮ⅡA对矽肺大鼠的治疗作用1)测量各组大鼠肺组织的湿/干重比。2)取各组大鼠肺组织石蜡包埋切片行H&E染色和Masson染色。3)免疫组织化学染色及RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、纤维连接蛋白1(FN1)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。4)Giemsa染色法计数各组大鼠BALF中的总细胞数及中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的数量。5)ELISA试剂盒测定各组大鼠肺组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素1β(IL-1β)的含量。1.3检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平采用活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平。1.4 TGF-β1/Smad信号通路关键因子测定1)采用定量RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Tgfb1及其下游Smad2、Smad3和Smad7的mRNA表达水平;2)采用 Western Blot 法检测肺组织中 TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、p-Smad3、Smad3及Smad7的蛋白表达水平。1.5 NOX4及Nrf2/ARE信号通路关键因子的测定1)采用定量RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中Nox4、Nrf2、Keap1及其下游Ho1、Nqo1的mRNA表达水平;2)采用Western Blot法定量检测各组大鼠肺组织中NOX4、细胞质Nrf2、细胞核Nrf2、Keap1及其下游HO-1、NQO-1的蛋白表达水平。2.体外实验2.1二氧化硅(Si02)及丹参酮ⅡA处理浓度筛选体外培养A549及HBE细胞,接种于96孔板,应用CCK-8试剂盒测定不同浓度二氧化硅及丹参酮ⅡA对A549和HBE细胞活力的影响。将细胞分别用不同浓度的 Si02(0、25、50、100、200、400、800μg/ml)或丹参酮 ⅡA(0、2.5、5、10、20、40、80μM)处理24h。CCK-8试剂盒检测细胞活性。筛选适当的Si02及丹参酮ⅡA处理浓度用于后续实验。2.2细胞分组及处理体外培养A549及HBE细胞,更换无血清培养基后,将A549细胞和HBE细胞分为以下几组:1)空白对照组;2)Si02组:单独Si02(100 μg/ml)处理细胞24 h;3)Si02+丹参酮ⅡA组:Si02(100μg/ml)联合不同剂量的丹参酮ⅡA(5、10 或 20μM)处理细胞 24 h。2.3 EMT标志物及TGF-β1/Smad信号通路关键因子测定1)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 E-cadherin、Vimentin、FN1、CollagenⅠ和α-SMA的蛋白表达水平。2)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 TGF-β1、p-Smad3、Smad3 及 Smad7 的蛋白表达水平。3)采用细胞免疫荧光法检测各组细胞中TGF-β1的表达水平。2.4检测各组细胞中的ROS水平应用ROS检测试剂盒检测各组细胞中的ROS水平。2.5 NOX4及Nrf2/ARE信号通路关键因子的测定1)采用 Western Blot 法检测各组细胞中 NOX4、Nrf2、Keap1、HO-1 及 NQO-1的蛋白表达水平。2)采用细胞免疫荧光法检测各组细胞中Nrf2的表达水平。3.统计学分析应用IBM SPSS Statistics 19.0统计学软件进行数据处理,计量资料若符合正态分布以平均值±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)或Kruskal-Wallis非参数检验,组间两两比较采用LSD法或Dunn-Bonferroni法。P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1.丹参酮ⅡA对矽肺大鼠的治疗作用1.1丹参酮ⅡA可缓解矽肺大鼠的肺损伤及纤维化矽肺组大鼠的肺湿/干重比较对照组显著增加,经丹参酮ⅡA治疗后显著下降。对各组大鼠肺组织进行组织病理染色,H&E染色显示矽肺组大鼠肺组织失去正常肺泡结构,肺泡壁增厚,伴有大量炎性细胞浸润,并在支气管树和血管床周围形成特征性的矽肺结节,表现为弥漫性肺纤维化,而经丹参酮ⅡA治疗后这些破坏作用得到缓解。Masson染色结果提示丹参酮ⅡA治疗能显著降低矽肺大鼠肺组织中的胶原沉积。免疫组织化学染色及RT-PCR检测显示丹参酮ⅡA治疗能显著降低矽肺大鼠肺组织中的Collagen Ⅰ、FN1及α-SMA的表达水平。以上结果表明丹参酮ⅡA治疗可减轻矽肺大鼠的肺损伤及纤维化。1.2丹参酮ⅡA可降低矽肺大鼠的炎症水平与对照组相比,矽肺组大鼠肺泡灌洗液中的总细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数量均显著增加,而经丹参酮ⅡA治疗后显著减少;矽肺组大鼠肺组织中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平较对照组显著增加,而经丹参酮ⅡA治疗后显著下降。2.丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的EMT及TGF-β1/Smad信号通路的激活2.1丹参酮ⅡA可抑制矽肺大鼠TGF-β1/Smad信号通路的激活通过RT-PCR和Western Blot分析,我们测定了 TGF-β1及其下游信号通路Smad2、Smad3和Smad7的活性。结果显示,矽肺大鼠肺组织的TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高,而经丹参酮ⅡA治疗后显著下降;矽肺大鼠肺组织的Smad2和Smad3的mRNA和蛋白水平均无显著改变,而p-Smad3和p-Smad2/3的蛋白表达水平显著升高,而经丹参酮ⅡA治疗后显著下降;作为TGF-β1/Smad通路的负调控因子,Smad7的mRNA和蛋白表达水平在矽肺大鼠肺组织中显著下调,而经丹参酮ⅡA治疗后显著上调。上述结果表明丹参酮ⅡA对TGF-β1/Smad信号通路的抑制作用与其对矽肺肺纤维化的保护作用有关。2.2丹参酮ⅡA抑制二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的上皮间质转化(EMT)及TGF-β1/Smad信号通路的激活2.2.1丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的EMT我们用Western Blot检测丹参酮ⅡA对二氧化硅(Si02)诱导的A549和HBE细胞的EMT的抑制作用。结果显示:用Si02(100μg/ml)处理A549和HBE细胞24 h后,其上皮标志物E-cadherin表达下调,间充质标志物Vimentin、FN1、Collagen Ⅰ和α-SMA的表达均上调。而丹参酮ⅡA共处理可上调两种细胞中E-cadherin的表达,下调Vimentin、FN1、CollagenⅠ和α-SMA的表达,并呈剂量依赖性。这些结果表明丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的EMT。2.2.2丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的A549及HBE细胞的TGF-β1/Smad信号通路的激活我们用Western Blot检测丹参酮ⅡA对二氧化硅(Si02)诱导的A549和HBE细胞的TGF-β1/Smad信号通路激活的抑制作用。结果显示:Si02(100 μg/ml)处理24 h后,A549和HBE细胞的TGF-β1及其下游p-Smad3表达显著上调,同时Smad7表达显著下调,而Smad3表达无显著变化,表明SiO2刺激对A549和HBE细胞中TGF-β1/Smad信号通路具有激活作用。而丹参酮ⅡA共处理可显著下调TGF-β1和p-Smad3的表达,上调Smad7的表达,并呈剂量依赖性。细胞免疫荧光分析也证实了丹参酮ⅡA对Si02诱导的A549和HBE细胞中TGF-β1表达的抑制作用。以上结果表明,丹参酮ⅡA在体外部分通过抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活抑制二氧化硅诱导的肺纤维化。3.丹参酮ⅡA可减轻二氧化硅诱导的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路3.1丹参酮ⅡA可减轻矽肺大鼠的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路我们采用活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒检测各组大鼠肺组织内氧化应激水平,结果可见矽肺组大鼠的ROS和MDA含量升高,伴随着SOD和GSH-Px活性的下降,而矽肺+丹参酮ⅡA治疗组大鼠的ROS和MDA含量相对于矽肺组大鼠下降,SOD和GSH-Px活性上升。以上结果表明丹参酮ⅡA具有减轻矽肺大鼠氧化应激的作用。我们通过RT-PCR和Western Blot检测丹参酮ⅡA是否可抑制NOX4的表达,并激活矽肺大鼠的Nrf2/ARE信号通路,从而对矽肺大鼠的氧化应激损伤起保护作用。结果显示矽肺组大鼠肺组织中NOX4的mRNA及蛋白表达水平显著升高,经丹参酮ⅡA治疗后其mRNA及蛋白表达水平均显著下降。矽肺组Nrf2及其下游HO-1和NQO-1的mRNA水平显著升高,经丹参酮ⅡA治疗后进一步上调。由于Nrf2核移位是Nrf2活化的必要步骤,因此我们分别评估了 Nrf2在细胞核内和细胞质中的表达,结果显示:矽肺组细胞核Nrf2蛋白表达上调,而胞质Nrf2蛋白表达降低,经丹参酮ⅡA治疗后这些作用进一步增强。与Nrf2一致,其下游蛋白HO-1和NQO-1的蛋白表达水平在矽肺组也显著上调,而丹参酮ⅡA治疗后这两种蛋白的表达水平进一步上调。与Nrf2相反,其抑制剂Keap1的mRNA和蛋白表达水平在矽肺组下调,而丹参酮ⅡA治疗进一步下调了 Keap1的表达。以上结果表明,丹参酮ⅡA部分通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路,来对矽肺的氧化应激损伤起保护作用。3.2丹参酮ⅡA减轻二氧化硅诱导的A549和HBE细胞的氧化应激,抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路我们采用活性氧(ROS)检测试剂盒检测丹参酮ⅡA对二氧化硅(Si02)诱导的A549和HBE细胞的氧化应激的抑制作用。用SiO2(100μg/ml)处理A549和HBE细胞24 h后,采用DCFH-DA检测ROS显示,A549细胞和HBE细胞的绿色荧光强度显著增强,而与丹参酮ⅡA共处理组绿色荧光强度显著下降。为了进一步阐明丹参酮ⅡA的抗氧化机制,我们用Western Blot检测了 A549和HBE细胞中NOX4的表达及Nrf2/ARE信号通路的活性。结果显示,Si02刺激导致细胞中NOX4蛋白表达增加,而丹参酮ⅡA共处理抑制了 NOX4蛋白的表达。Si02刺激导致细胞中Nrf2蛋白表达增加,而丹参酮ⅡA共处理进一步增加了 Nrf2蛋白的表达。细胞免疫荧光分析显示丹参酮ⅡA可增加Nrf2的表达并促进其在A549和HBE细胞中的核内聚集。相应的,SiO2刺激导致Nrf2下游HO-1和NQO-1的蛋白表达水平上调,丹参酮ⅡA共处理可进一步上调其表达。与Nrf2相反,其抑制剂Keap1的蛋白表达水平在SiO2组下调,而丹参酮ⅡA共处理进一步下调其表达。这些数据表明,丹参酮ⅡA在体外部分通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激。结论1.丹参酮ⅡA可有效缓解矽肺大鼠的肺组织结构破坏及纤维化,并减轻矽肺大鼠的肺部炎症反应。2.丹参酮ⅡA可抑制二氧化硅诱导的上皮间充质转化(EMT)及TGF-β1/Smad致纤维化信号通路的激活。3.丹参酮ⅡA可通过抑制NOX4的表达、激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激,从而发挥对矽肺的保护作用。意义在本研究中,我们应用矽肺大鼠模型和体外细胞实验,明确了中药单体丹参酮ⅡA对矽肺的抗炎、抗氧化及抗纤维化的保护作用,并进一步探讨了其分子效用机制,证明了丹参酮ⅡA可通过抑制二氧化硅诱导的上皮间充质转化(EMT)及TGF-β1/Smad信号通路的激活来减轻矽肺肺纤维化,并通过抑制NOX4的表达并激活Nrf2/ARE信号通路来减轻二氧化硅诱导的氧化应激,从而发挥对矽肺肺损伤及纤维化的保护和治疗作用。本研究表明丹参酮ⅡA可作为矽肺治疗的潜在药物,为矽肺防治提供了理论支持,并为新药的研发提供了理论基础。