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已有研究表明,免疫炎症反应导致肾小球、小管、间质病变时,肾细胞IL-6的表达增加;进展性肾脏疾病肾小管及间质出现大量单核细胞、巨噬细胞浸润,也是IL-6的重要来源。IL-6是重要的炎症因子,在体内通过复杂的细胞因子网络系统,对多种细胞、组织发挥生物活性作用。肠上皮细胞病变中发现TGF-β与IL-6的交叉对话作用,TGF-β是目前公认的最强的致纤维化因子。多种细胞因子通过JAK/STAT途径转导信号,参与细胞增殖、分化、功能发挥、凋亡等多种生命活动。然而,IL-6对肾小管上皮细胞增殖有何影响?是否对小管上皮转分化具有调节作用?其作用效应是否依赖于JAK/STAT信号通路的活化?目前尚不清楚。为此,我们进行下列三方面的观察:1、IL-6在体外对肾小管上皮细胞增殖及细胞周期的影响;2、IL-6在体外对介导肾间质纤维化的重要环节肾小管EMT的影响;3、JAK/STAT信号通路在IL-6介导的肾小管EMT机制中的可能作用。
第一章IL-6对人肾小管上皮细胞增殖及细胞周期的影响
目的:观察重组人白细胞介素-6(rIL-6)在体外对人近曲肾小管上皮细胞株(HK-2)增殖及细胞周期的影响。探讨IL-6对HK-2细胞作用的时间-效应及剂量-效应关系。方法:1、细胞培养及分组:待生长状况良好的HK-2细胞株60-80%细胞贴壁后,无血清培养基同步24h,然后根据分组给予相应的刺激。HK-2细胞给予不同浓度和时间IL-6刺激。2、指标检测:采用MTT比色法检测10、25、50ng/mL浓度的IL-6刺激30min、1h、6h、12h、24h、48h后HK-2细胞增殖情况;流式细胞仪检测10、25、50ng/mL浓度的IL-6刺激24h后细胞周期改变情况。结果:与刺激前比较,IL-6在10~50ng/mL作用浓度范围内,促进HK-2细胞增殖,呈剂量、时间依赖效应;IL-6影响HK-2细胞的DNA合成,10~50ng/mLIL-6可使S期细胞增多。小结:IL-6可促进HK-2细胞增殖,呈剂量、时间依赖效应。
第二章IL-6对人肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化的影响
目的:探讨IL-6在体外对肾小管上皮细胞转分化的影响。方法:1、细胞培养及分组:待生长状况良好的HK-2细胞株60-80%细胞贴壁后,无血清培养基同步24h,然后根据分组给予相应的刺激。HK-2细胞给予不同浓度和时间IL-6刺激。对照组不予IL-6刺激。2、指标检测:采用荧光定量PCR技术检测0h、6h、12h、24h、48h、72h不同时间点α-SMAmRNA、E-cadherinmRNA的表达。采用流式细胞仪检测25ng/mL浓度的IL-6刺激1h、6h、12h、24h、48h后α-SMA阳性细胞表达百分数;同样方法检测10、25、50ng/mL浓度的IL-6刺激24h后α-SMA阳性细胞表达百分数。采用免疫荧光技术检测25ng/mL浓度的IL-6刺激24h、48h、72h后α-SMA、E-cadherin蛋白的表达。采用倒置显微镜观察25ng/mL浓度的IL-6刺激24h、48h、72h后细胞形态改变。结果:与刺激前比较,IL-6以时间依赖方式上调HK-2细胞α-SMAmRNA的表达,下调E-cadherinmRNA的表达;与刺激前比较,IL-6以剂量、时间依赖方式上调α-SMA阳性细胞表达百分数;免疫荧光显示,与刺激前比较,IL-6刺激后E-cadherin表达减弱,α-SMA表达增强;IL-6刺激后,诱导肾小管上皮细胞发生细胞肥大或转变为梭形长条样。小结:IL-6能够促进肾小管上皮细胞转分化。
第三章JAK/STAT信号通路在IL-6介导肾小管上皮细胞转分化中的作用
目的:研究Janus激酶(JAK)和信号转导因子和转录活化因子(STAT)途径的激活在IL-6介导人近端肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法:1、细胞培养及分组:待生长状况良好的HK-2细胞株60-80%细胞贴壁后,无血清培养基同步24h,将细胞分为空白对照组、IL-6组、IL-6+100μMAG490组。然后根据分组给予相应的刺激。2、指标检测:采用Westemblot方法检测0、5、10、25、50ng/mL浓度的IL-6刺激30min,以及IL-6(25ng/mL)刺激0、15min、30min、60min、120min后P-STAT1和P-STAT3蛋白的表达水平;同样方法检测,AG490预处理细胞4h,IL-6(25ng/mL)分别刺激30min后及48h后P-STAT1、P-STAT3、P-JAK2和α-SMA、E-cadherin蛋白的表达水平。结果:与刺激前比较,IL-6以时间和剂量依赖方式上调HK-2细胞P-STAT1、P-STAT3的表达,高峰发生在30min:AG490部分抑制STAT1、STAT3、JAK2的磷酸化,部分抑制IL-6诱导的α-SMA蛋白表达的上调、部分抑制IL-6诱导的E-cadherin蛋白表达的下调。小结:HK-2细胞中,JAK/STAT信号通路的激活可能参与了IL-6介导的肾小管上皮细胞转分化的发生。
结论1、IL-6能够促进HK-2细胞增殖。
2、IL-6能够促进肾小管上皮细胞转分化。
3、JAK/STAT信号通路的激活可能参与了IL-6介导的肾小管上皮细胞转分化的发生。