目的:骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一类具有向神经细胞分化能力的多潜能干细胞,可应用于神经功能缺损的细胞移植治疗。本实验研究骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增的特点,旨在培养出高纯度的骨髓间充质干细胞。探讨大鼠脑组织匀浆上清液对BMSCs向神经元样细胞分化的影响,在以碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)为基础的诱导液中分别加入正常和损伤大鼠脑组织匀浆上清液,观察各组神元样细胞的诱导率及诱导后细胞活力的差异。方法:无菌条件下取大鼠股骨和胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法对骨髓间充质干细胞进行体外培养和传代,选取第3代、第5代和第7代骨髓间充质干细胞接种于96孔板,连续10天每天同一时间计数各代的细胞数,绘制细胞生长曲线图。采用流式细胞仪检测第4代骨髓间充质干细胞表面的CD29,CD44和CD45抗原的表达。取第4代的BMSCs,按105/ml浓度接种于6孔板和96孔板内,以1mmol /L浓度BME和含20%血清的DMEM培养基预诱导24 h后,分别加入bFGF 20ng/ml、bFGF 20ng/ml+正常大鼠脑匀浆上清100ul/ml、bFGF 20ng/ml+损伤大鼠脑匀浆上清100ul/ml,诱导至细胞分化,另留取空白对照组不加任何诱导剂。细胞培养及诱导过程中每天在倒置显微镜下连续观察其形态变化。取6孔板内各组诱导后48h的细胞进行爬片,采用免疫细胞化学染色的方法分别检测各组诱导分化后细胞神经元特异性烯醇化酶(Neural-specific enolase, NSE)、微管相关蛋白-2(Microtubule associated protein 2, MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达,计算出诱导阳性率。取96孔板内诱导后的细胞用MTT法检测各组诱导后5h、24h、48h、3d、5d诱导后细胞的生长状况。结果:倒置显微镜下观察可见培养24h后部分细胞贴壁呈多角形,72h后贴壁细胞增大、分裂增殖,2周左右细胞汇合至70%～80%,此时可传代。传代24 h后BMSCs即可贴壁生长,约5 d～7 d可铺满瓶。此后随着换液、传代,细胞逐渐表现为排列旋涡状、菊花状的均一梭形。第3、5、7代细胞生长曲线测定显示这3代细胞具有相同的生长特性,表现为传代后约两天为潜伏期,细胞生长缓慢,第3天进入指数生长期,这一时期持续到第8天,此后进入平台期;随着传代次数的增多,细胞增殖速度有减弱趋势。流式细胞术检测第4代BMSCs结果为CD29、CD44和CD34的表达率为99.8%、99.7 %和2.2%。BMSCs预诱导24h,可见少量细胞逐渐向胞核方向收缩,加入各诱导剂后上述变化增多,有突起形成并随时间增长,部分视野可见突起交织成网状,对照组细胞形态无变化。免疫细胞化学染色可见各诱导组细胞均有部分细胞NSE和MAP-2阳性,GFAP阴性。对照组均不表达NSE、MAP-2和GFAP。计算各组细胞的诱导阳性率为:bFGF诱导组NSE的表达率为44.50%,MAP-2的表达率为45.70%;正常大鼠脑组织匀浆上清诱导组NSE的表达率为63.10%,MAP-2的表达率为65.30%;损伤大鼠脑组织匀浆上清诱导组NSE的表达率为73.30%,MAP-2的表达率为75.60%。MTT结果显示加入脑组织匀浆上清的细胞生长状况好于对照组,其中损伤匀浆组的细胞活力更好。结论采用全骨髓贴壁培养法可以培养出高纯度的骨髓间充质干细胞,第3、5、7代细胞的生长特性基本相同,传代后均经历潜伏期、指数生长期和平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖有减弱的趋势。大鼠脑组织匀浆上清液能提高其骨髓间充质干细胞向神经细胞方向的分化的阳性率和诱导后细胞的活力。相比于正常脑组织匀浆,损伤匀浆的作用更强。