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造血激素(astakine,AST)是一种甲壳动物中具有促进造血组织细胞分化和增殖的细胞因子。有学者研究发现在软尾太平蜊蛄中发现F1F0-ATP synthaseβ亚基作为造血激素的受体参与了细胞分化,同时在我们前期研究中发现对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)选择F1F0—ATP synthaseβ亚基(BP53)作为侵染宿主的靶点之一,即WSSV与造血激素有相同的作用蛋白——BP53。根据已有的研究结果,我们推测WSSV可能通过BP53感染宿主,并与造血激素竞争同一受体,进而干扰细胞分化。了解造血激素在WSSV感染中的作用可以为解析WSSV侵染宿主的分子机制提供理论基础。
本研究共分5个部分:利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)造血激素(lvast)全长cDNA；原核表达、纯化造血激素蛋白(INAST),并制备多克隆抗体；利用ELISA,竞争ELISA和Dynabeads磁珠免疫结合法分析BP53、LVAST、VP37三种蛋白的结合关系；体内中和实验验证造血激素蛋白对凡纳滨对虾抗WSSV感染力的影响；RNAi结合实时荧光定量PCR分析astakine对WSSV复制的影响。
1.凡纳滨对虾造血激素(lvast)全长cDNA克隆:利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆凡纳滨对虾造血激素lvast全长cDNA,(GenBank登录号:HM594944),并对该基因进行了生物信息学分析。该基因全长共1486 bp,含有1个372 bp的开放阅读框,编码124个氨基酸,估算分子量为13.3 KD。凡纳滨对虾包含一个Prokineticin结构域。氨基酸序列比较表明,凡纳滨对虾造血激素lvast与斑节对虾和软尾太平蜊蛄相应序列的同源性分别为87％和56％；与脊椎动物相应序列的同源性低于36％。
2.蛋白表达及抗体制备:构建了重组表达载体pBAD／gⅢA-lvast并转化于大肠杆菌E.coli。经L-阿拉伯糖诱导后的表达产物用SDS-PAGE和Western-blot检测,显示有与预期相符合的目的蛋白,并利用纯化的蛋白制备了较高效价的多克隆抗体(1:10000)。
3.BP53、LVAST、VP37三种蛋白的结合关系分析:通过ELISA、竞争ELISA和Dynabeads磁珠免疫结合法验证了BP53、LNAST、VP37三种蛋白的结合关系。研究结果表明LVAST与VP37之间不存在直接的结合作用,BP53具有分别与LVAST、VP37结合的能力。同时VP37能够抑制LVAST与BP53的结合,且这种竞争抑制作用与VP37蛋白量有相关性,即增加VP37蛋白量,竞争抑制作用相应增强。研究还发现BP53与LVAST和VP37的结合共用同一位点,存在竞争结合作用。
4.造血激素蛋白对凡纳滨对虾抗WSSV感染力的影响:我们以凡纳滨对虾为实验对象注射LVAST蛋白,然后对虾进行攻毒(WSSV)处理,结果显示:注射LVAST的虾无论从开始死亡的时间还是半数死亡的时间都比阳性对照组延迟了将近两天。证明体外注射LVAST能够提高对虾对抗WSSV感染的能力,起到了一定的保护作用。
5.Astakine对WSSV复制的影响:通过RNAi技术,注射lvast-dsRNA沉默lvast基因,再进行WSSV感染实验。以vp37为目的基因检测WSSV复制,β-actin作为内参基因,使用实时荧光定量PCR(SYBR-GreenⅡReal-time PCR)技术,采用AACT相对定量法分析LVAST对WSSV复制的影响。以0时刻vp37的量为1,分析显示:阳性对照组在5 d达到最大值；LVAST注射组的vp37水平(5 d内)约为阳性对照组的1／5,在6 d达到最大值；lvast-dsRNA注射组在5 d达到最大值,vp37水平均高于阳性对照组(2倍)。说明LVAST能够在一定程度上抑制WSSV的复制,而造血激素基因的缺失能够使WSSV的复制速度加快。
综上所述,我们可以得出以下结论:LVAST与VP37作用于BP53存在竞争结合作用。INAST与BP53的结合受到VP37的抑制,且这种竞争抑制作用随着VP37蛋白量增加而相应增强。同时我们还发现LVAST与WSSV的增殖作用存在相关性。本研究为深入开展LVAST在WSSV感染中的作用机制奠定了理论基础。