论文部分内容阅读
猪机体脂肪的沉积状况影响猪肉的生产效率、品质以及消费者对猪肉的选择。其中,肌内脂肪的含量及成分直接影响猪肉的风味、嫩度、色泽等生化指标,是影响肉品质的主要因素之一;而皮下脂肪(subcutaneous adipose tissue,SAT)含量与猪瘦肉率存在负相关关系,直接关乎生猪的经济价值。因此,肉质调控的关键问题在于如何在降低皮下脂肪沉积的同时又能增加肌内脂肪的含量。然而,内脏脂肪如肾周脂肪(perirenal adipose tissue,PAT)具有较高的代谢活性,对胰岛素抵抗和肾上腺素的刺激比较敏感,具有更好的预测疾病功能。有研究表明,SLC35D3基因与肥胖和代谢疾病相关,因此我们对SLC35D3基因进行下一步研究。本研究以肥胖型梅山猪、矮小肥胖型巴马猪,以及肌内脂肪含量少且皮下脂肪薄的瘦肉型大白猪为试验动物模型,通过RACE技术得到SLC35D3基因的cDNA序列,并通过RT-qPCR、WB等技术获得SLC35D3基因在梅山猪组织(内脏组织、背最长肌(longissimusdorsi,LD)以及皮下脂肪、肾周脂肪和板油脂肪(leaf lard,LL))中的表达谱。根据组织表达结果,我们选取梅山猪、巴马猪和大白猪背最长肌以及皮下脂肪、肾周脂肪和板油脂肪组织进行了进一步研究。最后,我们利用RNAi技术在转录水平上对SLC35D3基因对猪肌内脂肪细胞内脂滴沉积的内在调控机制进行了进一步鉴定。主要得到以下结果:(1)SLC35D3基因的克隆及序列分析首先,我们通过RACE技术,得到SLC35D3基因的cDNA序列,共2238 bp,其中包括1272 bp CDs区,966 bp 3’UTR,编码423个氨基酸;BLAST结果表明,该基因编码的氨基酸序列与绵羊亲缘关系较近,与人、大猩猩、小鼠亲缘关系稍微远一些,但仍属于同一个大的分支。进一步生物信息学分析结果表明,SLC35D3蛋白包含8个跨膜结构域,不存在信号肽结构,二级结构主要是α螺旋(37.12%)和无规则卷曲(33.57%),和少部分β折叠(7.8%)。疏水区域明显有α螺旋结构。功能位点包含3个O-糖基化位点,42个磷酸化位点,无N-糖基化位点。SLC35D3基因的克隆及序列分析为后续研究SLC35D3基因的功能奠定分子生物学基础。(2)SLC35D3基因的组织表达规律及品种差异研究SLC35D3基因的mRNA表达水平研究结果显示,SLC35D3基因在肌肉组织和脂肪组织中高表达,在其他组织中表达量比较低,说明SLC35D3可能参与脂肪代谢过程的调控。不同品种之间脂肪和肌肉组织表达规律研究结果表明,在皮下与肾周脂肪中,SLC35D3基因在梅山与巴马猪中表达量比大白猪低,且在肾周脂肪中差异显著(P<0.05)。对于板油和背最长肌组织,SLC35D3基因在大白猪中表达水平最高,次之是梅山猪,在巴马猪中表达量显著低于大白和梅山猪,差异均显著(P<0.05)。用WB技术对蛋白表达水平进行检测,结果显示与mRNA表达水平一致。以上结果显示,SLC35D3的表达水平与三个品种猪肌内脂肪含量和体脂率的变化规律基本上呈负相关关系,这表明,SLC35D3的表达水平可能与猪的脂肪沉积情况密切相关。(3)干扰SLC35D3对猪肌内脂肪细胞脂滴沉积的影响本试验首先对猪肌内前体脂肪细胞进行了分离培养,然后结合RNAi技术在细胞水平初步研究猪SLC35D3基因对脂肪沉积的分子机制的调控。经过筛选得到SLC35D3基因的有效干扰片段siRNA-3,干扰达效果到50%,转染至肌内前体脂肪细胞后,与对照组相比脂肪细胞分化标志基因PPARγ表达有显著升高(P<0.05),脂肪合成关键基因aP2、SREBP-1c的表达也有显著升高(P<0.05),C/EBPα表达量有升高但不显著。同时,脂肪分解关键基因ATGL(P<0.05)和HSL以及Sirt1(P<0.05)的表达降低了。此外,培养基中游离脂肪酸的含量显著升高(P<0.001),细胞内脂滴增多。结果表明,抑制SLC35D3基因的表达后,脂肪细胞合成代谢相关基因表达增强,而脂肪分解代谢相关基因的表达水平降低,显著增加了肌内脂肪的沉积。因此,SLC35D3基因负调控肌内脂肪细胞合成代谢相关基因的表达,抑制肌内脂肪细胞分化,减少脂肪合成量,进而影响肌内脂肪的沉积。通过克隆测序,我们得到SLC35D3基因的序列片段并进行了一系列生物信息分析。梅山猪的组织表达结果分析表明,该基因在脂肪组织以及肌肉组织中高表达;脂肪组织和肌肉组织的品种差异研究结果表明,该基因与三个品种猪肌内脂肪含量以及体脂率的变化规律基本上呈负相关关系;最后,我们通过RNAi技术在细胞水平进一步验证SLC35D3基因负调控脂肪的沉积。