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近年来,牛呼吸系统疾病(bovine respiratory disease,BRD)已成为危害我国肉牛养殖业的主要疾病之一,尤其是在我国“北牛南调,西牛东运”的肉牛育肥模式下,该病的发生和传播更为普遍。据统计,经长途运输的育肥架子牛,有60%左右会发生BRD。BRD主要由牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)、牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida,Pm)和牛溶血曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)引发,部分病例为混合感染。同时,上述病原均为苛养菌,且对常用药物敏感性不同,尤其是牛支原体,不但分离培养周期长,还对兽医临床常用的β-内酰胺类抗生素具有天然抗性,如不能正确做出诊断,就会造成较大经济损失。为此,研发一种可快速、准确鉴定BRD主要病原的方法,已迫在眉睫。其中,PCR-ELISA方法是PCR反应与地高辛检测系统的结合,已普遍用于食品及病原微生物的快速检测,受到了相关学者和基层工作者的青睐。该方法主要是将PCR引物标记地高辛、探针标记生物素并将链霉亲和素结合在ELISA板上,利用生物素与亲和素的高亲和力,将杂交产物固定在ELISA板上,加入酶的相应底物,根据显色反应或酶标仪读取数据判定结果。该方法可实现同时对多种病原体进行定性检测,具有快速、操作简便等特点。为此,本研究利用探针引物双标记法建立了同时检测BRD三种主要病原体的多重PCR-ELISA检测方法。具体实验结果如下:(1)种间特异性基因的筛选将目标菌株的全基因组序列与NCBI的动物nt库以及细菌nt库(去除了目标菌种序列)进行比较,对没有比对到数据库的序列进行筛选,进一步采用orthomcl对目的基因进行聚类分析,最终得到667组牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌特异性基因,380组溶血曼氏杆菌特异性基因。(2)多重PCR检测方法的建立根据筛选出的种间特异性基因,建立多重PCR检测方法,对引物条件、退火温度、循环数等进行优化,最终筛选出三对特异性引物,退火温度为54.5℃,最佳循环次数为30。多重PCR的灵敏度Pm为6.8×10~3CFU/mL、Mh为3.7×10~4CFU/mL、M.bovis为1.1×10~6CFU/mL。(3)多重PCR-ELISA检测方法的建立采用化学变性杂交法建立多重PCR-ELISA检测方法,并对条件进行优化,结果显示,包被液(链霉亲和素)浓度为5μg/mL,封闭液(BSA)浓度为0.5%,封闭时间为20min,过氧化物酶标记的抗地高辛抗体稀释1000倍,显色时间为20min,探针浓度为0.5mmol/10mL时,该检测方法灵敏度Pm为6.8×10~1CFU/mL、Mh为3.7×10~3CFU/mL、M.bovis为1.1×10~4CFU/mL。