胃癌是全世界范围内的一种常见恶性肿瘤,其死亡率在所有癌症中排名第二,发病隐匿,预后较差。阿霉素是一种广泛应用于临床治疗的化疗药物,抗瘤谱广,疗效明显,但是由于其副作用大、功能性器官毒性强使其临床应用受到很大限制。胃癌化疗治疗中迫切需要阿霉素与其他无毒或者低毒物质联合应用,以达到增强阿霉素抗肿瘤效应和降低功能器官损伤的目的。本课题研究引入新型人工合成的α-生育酚琥珀酸酯衍生物VCPA,从临床前研究水平探索其与阿霉素联合应用对胃癌的治疗作用。研究发现VCPA可以通过提高细胞内ROS水平促进细胞凋亡,低浓度的VCPA对胃癌细胞几乎无影响,与DOX联合用药后可以通过调节Bcl-2/Bax的比例,激活线粒体凋亡途径,最终导致胃癌细胞凋亡。MAPK信号通路在联合用药中也被激活,但是在DOX诱导的胃癌细胞凋亡中并不起保护作用。体内动物实验也进一步在人胃癌细胞裸鼠移植瘤中证实了两药联合的抗肿瘤效应。综上所述,本研究从体内和体外水平共同阐明了 VCPA与DOX联合用药对胃癌的治疗作用。研究内容主要包括以下两个部分:第一部分:小分子化合物VCPA联合阿霉素诱导人胃癌细胞凋亡作用的体外研究目的:胃癌在我国发病率仍较高,手术治疗仅能切除可见肿瘤,放化疗治疗仍然是重要的辅助治疗手段。VCPA是一种新型人工合成的α-生育酚琥珀酸酯衍生物,可能具有与α-生育酚琥珀酸酯类似的促进肿瘤细胞凋亡的作用。本课题研究分别选用了一种高分化胃癌细胞系SGC-7901和一种低分化胃癌细胞系MGC-803,拟通过体外细胞学与分子生物学的技术,明确小分子化合物VCPA与阿霉素联合用药后抑制胃癌细胞生长和促凋亡的作用及其可能的分子生物学机制。方法:通过CCK-8、平板克隆实验,检测不同浓度的VCPA对胃癌细胞增殖速度和增殖能力的影响,拟合计算VCPA作用于胃癌细胞48小时的IC50值以及DOX/VCPA联合用药对胃癌细胞存活的影响;通过不同荧光标记,流式细胞术检测联合用药对胃癌细胞周期、细胞凋亡率、细胞内ROS水平以及线粒体膜电位变化的影响;通过电子显微镜直接观察细胞内线粒体结构的变化;通过Western Blot检测联合用药对线粒体凋亡通路和MAPK信号通路中重要蛋白的影响;通过分离线粒体与胞浆蛋白,观察细胞色素c的迁移情况;通过使用MAPK信号通路中关键蛋白的特异性抑制剂,明确MAPK信号通路在联合用药促进胃癌细胞凋亡中的作用;通过Bcl-2腺病毒过表达胃癌细胞,观察联合用药细胞的存活率,明确Bcl-2在联合用药中的作用。结果:单药VCPA可以抑制胃癌细胞的生长及克隆形成,VCPA作用于SGC-7901和MGC-803的48小时的IC50值分别为14.25和16.91 μM,VCPA对胃癌细胞的抑制作用呈时间、剂量依赖性;单药VCPA可以提高胃癌细胞内ROS水平,高浓度VCPA对胃癌细胞周期无影响,但是可以促进细胞凋亡;DOX/VCPA联合用药可以明显抑制胃癌细胞生长,其分子机制可能与促进DOX诱导的ROS依赖的线粒体凋亡途径有关;DOX/VCPA联合用药可以激活MAPK信号通路,但是MAPK信号通路的激活与联合用药促进胃癌细胞凋亡无关;Bcl-2腺病毒过表达的胃癌细胞能有效逆转联合用药导致的胃癌细胞凋亡。结论:VCPA能够增强DOX诱导的ROS依赖的线粒体凋亡途径导致胃癌细胞凋亡。第二部分:小分子化合物VCPA联合阿霉素抑制人胃癌细胞裸鼠皮下荷瘤生长的体内研究目的:研究VCPA与阿霉素联合用药对人胃癌细胞裸鼠皮下荷瘤的生长的抑制作用。方法:建立人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下荷瘤模型。随机分为4组,每组5只:生理盐水对照组、单药VCPA组、单药DOX组以及DOX/VCPA联合用药组。按照10mg/kg体重的VCPA或/和1mg/kg体重的DOX,腹腔注射,隔天一次,连续注射3周。游标卡尺每隔两天测量裸鼠皮下的最长径和最短经,并按照肿瘤体积评估公式V =0.5 ×1×w2计算肿瘤体积大小。实验结束后处死裸鼠,分别取心、肝、肾和荷瘤组织,并称量荷瘤组织重量,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色心、肝、肾组织,观察两药联合是否会影响心、肝、肾等器官组织结构;荷瘤组织切片免疫组化染色检测Ki67与CD31的表达,TUNEL检测荷瘤组织内细胞凋亡情况。结果:对照组与处理组给药期间裸鼠体重均有所下降,但各组下降的趋势无统计学差异;DOX/VCPA联合用药比单药DOX抑制皮下荷瘤生长的效果更明显;联合用药并未对心、肝和肾功能性器官造成明显损害;联合用药组组织内Ki67与CD31的表达均最低,而细胞凋亡比率最高。结论:DOX/VCPA联合用药能明显抑制人胃癌裸鼠皮下荷瘤的生长,同时未造成正常功能性器官心肝肾的组织损伤。