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1 目的基于国医大师洪广祥“治肺不远温”学术思想,深入探讨“全程温法治疗肺间质纤维化”之代表专方温肺化纤汤的理论脉络和临床经验。在小鼠肺间充质干细胞线粒体形态学改变的微观发现基础上,结合中医“温阳扶正”之宏观理论,应用相关实验技术,初步探究温肺化纤汤对氧化应激环境下小鼠肺间充质干细胞线粒体质量的调控及其相应分子机制。2 方法2.1 理论探讨搜集并梳理亘古至今有关肺间质纤维化的经典文献,总结各大医家对肺间质纤维化的理论认识渊源和临证治则经验。阐述本团队对肺间质纤维化病因病机的探索过程,解释“全程温法治疗肺间质纤维化”的定义、原理及要点,展示团队代表性专方温肺化纤汤的药用和疗效;以调控线粒体质量为切入点,将线粒体微观之改变与中医宏观之理论对应融合。2.2 实验研究2.2.1 提取鉴定小鼠肺间充质干细胞（MLMSCs）并建立氧化应激模型分离C57BL/6小鼠肺组织,从中提取原代细胞,逐步传代纯化培养,通过镜下观察细胞形态、绘制细胞增殖曲线、流式技术分析细胞特征表型等方式以鉴定MLMSCs。使用H2O2（2000、1500、1000、800、600、400、200、100μM）作用细胞6h,经CCK8法检测细胞活力以建立模型。2.2.2 分组并观察温肺化纤汤对氧化应激下MLMSCs的影响使用CCK8法检测温肺化纤汤（2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/m L）对健康MLMSCs和H2O2诱导的MLMSCs活力影响,确定科学的用药浓度并分组,设立NAC 5m M组作为阳性对照,检测对比各组细胞SOD活性、胞内ROS水平和细胞凋亡率。2.2.3 探讨温肺化纤汤对H2O2诱导的MLMSCs线粒体质量的调控流式细胞仪检测MLMSCs线粒体膜电位,酶标仪检测MLMSCs胞内ATP,透射电镜观察MLMSCs线粒体超微结构,RT-q PCR检测细胞线粒体动力学相关基因FIS1、MFN1、MFN2、DRP1、OPA1和PGC-1α的m RNA水平,Western blot检测MLMSCs线粒体自噬相关蛋白LC-3Ⅱ、Beclin-1和p62表达水平。2.2.4 初探温肺化纤汤调控MLMSCs线粒体质量的分子机制RT-qPCR技术检测MLMSCs中PINK1、Parkin的m RNA水平,Western blot检测MLMSCs线粒体PINK1、Parkin蛋白表达水平。3 结果3.1 理论探讨本文总结了中医对肺间质纤维化的认识演变过程,归纳了中医代表性治法及中药相关研究进展。在此基础之上,引出本团队治疗肺间质纤维化之观点,即“全程温法治疗肺纤维化”,通过对此观点及代表方温肺化纤汤的阐述、探讨,结合前期研究,将线粒体微观之改变与中医宏观理论对应融合,从“细胞之阳”角度,将线粒体、肺间充质干细胞、肺间质纤维化、温肺化纤汤、全程温法串联成一个完整的理念回路,为后续的实验研究奠定了坚实的理论依据。3.2 实验研究3.2.1 成功鉴定MLMSCs并确定氧化应激模型第10代MLMSCs镜下外观呈梭形,多以放射状排列,形态上趋于一致化,种植细胞24h后进入对数生长期,该期至少维持48h。表型鉴定结果:CD11b阳性表达率为3.01%,CD45表达率为2.79%,而CD44、CD54和Sca-1的阳性表达率分别为97.8%、95.2%、98.3%。MLMSCs免疫表型特征为CD11b阴性,CD45阴性,CD44阳性,CD54阳性,Sca-1阳性。氧化应激模型:选择600μM的H2O2作用MLMSCs持续6h,细胞存活率下降为对照组的59.8%（P<0.01）。3.2.2 温肺化纤汤对H2O2诱导的MLMSCs具有抗氧化保护作用经CCK8检测,浓度500μg/m L至15.625μg/m L范围内的温肺化纤汤对健康MLMSCs细胞活力的影响与对照组比不显著（P>0.05）;当浓度增加至1000、2000μg/m L,其影响具有差异（P<0.01）;针对H2O2诱导的MLMSCs,当温肺化纤汤浓度达到62.5μg/m L,对细胞活力影响与模型组比差异明显（P<0.05）;据上述结果选择500μg/m L和62.5μg/m L温肺化纤汤作为后续研究大小剂量组。造模后,细胞SOD水平降低（P<0.01）,胞内ROS水平升高（P<0.01）,细胞凋亡率提升显著（P<0.01）;温肺化纤汤组及NAC组均能提升SOD水平（P<0.01）,降低胞内ROS和细胞凋亡率（P<0.01）,500μg/m L温肺化纤汤组的逆转效果均较NAC组更好（P<0.01）。3.2.3 温肺化纤汤能调控H2O2诱导的MLMSCs线粒体质量造模后线粒体膜电位和ATP水平下降显著（P<0.01）,温肺化纤汤组及NAC组膜电位和ATP水平均提升（P<0.05）,500μg/m L温肺化纤汤组提升效果较NAC组更好（P<0.05）。经透射电镜观察,模型组线粒体呈畸形的长条状,嵴疏松、断裂,基质密度不均匀;NAC组和62.5μg/m L温肺化纤汤组中的线粒体仍异常明显,但能分辨线粒体嵴;500μg/m L温肺化纤汤组线粒体形态大多接近椭圆形,可见较为清晰的线粒体嵴和膜;此外,温肺化纤汤组中可见自噬小体。模型组细胞FIS1、MFN1、MFN2、DRP1、OPA1和PGC-1α的m RNA水平均有下降（P<0.01）,在500μg/m L温肺化纤汤组中FIS1、MFN1、MFN2和PGC-1α的m RNA水平较模型组显著上升（P<0.01）,DRP1有所提高（P<0.05）,OPA1差异不明显（P<0.05）。与模型组相比,500μg/m L温肺化纤汤组中LC-3Ⅱ和p62蛋白表达显著上升（P<0.01）,Beclin-1表达略提高（P<0.05）。3.2.4 温肺化纤汤可能经PINK1/Parkin通路调控MLMSCs线粒体质量造模后细胞PINK1、Parkin的m RNA水平下降（P<0.01）,温肺化纤汤组中上述m RNA水平上升（P<0.01）。与对照组相比,模型组线粒体PINK1蛋白表达升高、Parkin表达下降（P<0.05）,温肺化纤汤组中上述蛋白表达均较模型组升高（P<0.05）。4 结论温肺化纤汤可以调控小鼠肺间充质干细胞线粒体质量以发挥抗氧化保护作用,其机制可能与激活PINK1/Parkin信号通路相关。