辐射损伤后造血及免疫功能恢复迟缓是导致ARS患者死亡的主要原因。辐射剂量越大,造血及免疫功能受损越严重。根据欧洲血液与移植合作组于2005年推出的核事故医学救治指南(METREPOL)的分级标准,将血液(H)、消化道(G)、神经系统(N)、及皮肤(C)损伤分为1-4级,分级越高,损伤越严重。1级为组织器官功能能够完全恢复正常,而4级则为组织器官致命的、不可逆损伤,无自身恢复的可能性,2、3级介于两者之间。分级不同,患者救治的原则不同。仅造血系统而言,H1级患者可暂不作处理,密切观察、随访,H2-4级患者由于造血受到不同程度的抑制,需要给与积极有效的治疗。造血干细胞移植虽然能够快速恢复患者造血,但它首先受到供者来源的限制,辐射损伤后短时间内很难找到HLA配型全相合的异基因造血干细胞供者,而且异基因造血干细胞移植后GVHD、免疫重建困难等并发症同样是导致ARS患者死亡的重要原因,因此,METREPOL推荐异基因造血干细胞移植仅适用于不合并严重烧伤及其他组织创伤的H4级患者。而H2-3级患者主要依靠细胞因子、成份血制品输注等对症支持治疗。但H3级以及部分介于H3-H4级之间的患者,由于自身残存造血干细胞量少,在常规支持治疗下血象恢复缓慢,导致此部分患者在相当长的时间内面临出血、感染而继发死亡的风险。因此如何促进此部分患者的造血及免疫恢复,减少相关并发症、提高其生存是本课题研究的重点。很多研究尝试利用造血干细胞能够在体内快速倍增的特点,发挥其支持造血的作用,但自体造血干细胞由于辐射损伤后残存数量较少,很难有实际应用价值,异基因造血干细胞虽然数量上有保证,但由于辐射损伤后患者免疫功能低下,异基因造血干细胞很容易发生稳定高比例植入,取代患者自身造血,从而导致GVHD等并发症发生。从既往ARS患者治疗过程中发现,造血干细胞一过性植入,同样能够起到支持造血的作用,而GVHD的发生与供者造血干细胞在受者体内的植入比例密切相关,如何通体外处理降低供者造血干细胞的生长、增殖活性,使其仅在受者体内短时间、低比例植入,起到促进受者自身造血恢复,同时避免GVHD的发生是本课题重点要解决的问题。与其他途经相比,体外照射是降低造血干细胞活性最为简单有效的方法,在第一部分的研究中我们,利用半相合小鼠供受者模型(CB6F1→BALB/c),将动员后供者脾脏造血干细胞分别给与2.5Gy、5Gy、7.5Gy、10Gyγ射线照射后输入6 Gy亚致死剂量辐射损伤的受者小鼠体内(3x107/只),发现照射后供者造血干细胞能够加快受者小鼠的造血恢复,而且体外照射剂量越小,支持造血的作用越明显。以2.5Gy照射细胞效果最好,5Gy、7.5Gy照射细胞次之,10Gy照射细胞对造血几乎无明显促进作用。同时我们利用流式细胞仪联合实时定量PCR的方法检测供者细胞在受者小鼠体内的植入情况发现,2.5Gy照射供者造血干细胞在部分受者小鼠外周血中形成稳定、高比例植入(>95%),从而取代受者造血,引发GVHD导致小鼠死亡。而5Gy照射造血干细胞且仅在受者外周血中形成微量植入/嵌合(10-3-10-4水平),持续2-4月后被受者完全被排掉,观察至术后半年,无一例小鼠发生GVHD。照后1月,未在受者外周血中检测到经7.5Gy、10Gy照射的供者细胞成分,两组小鼠同样无GVHD发生。通过上述实验我们发现7.5Gy、5Gy照射供者造血干细胞输注能够起到既支持受者自身造血恢复又无GVHD发生的作用,为ARS的临床治疗提供了新思路。随后我们将7.5Gy、5Gy照射供者造血干细胞与G-CSF联合后观察其对6 Gy亚致死剂量以及8Gy致死剂量辐射损伤小鼠的影响,发现联合后对造血恢复有很好的协同作用,尤其是能够显著提高血红蛋白及血小板的水平,而且能大幅提高8Gy辐射损伤小鼠生存,其中以5Gy照射细胞联合G-CSF效果最为明显,显著优于单独使用G-CSF(70+10.1% VS 30+10.1%)。植入检测发现,7.5Gy照射细胞在8Gy辐射损伤小鼠体内形成微量嵌合,2-4个月内被受者排掉。5Gy照射细胞在8Gy辐射损伤小鼠体内的植入比例差别较大,从微量嵌合到高比例植入,但均不稳定,2-4个月内被排掉,均恢复受者小鼠自身造血,两细胞治疗组无一例发生GVHD。这对于重度骨髓型放射病有极少量残存自身造血干细胞患者的临床治疗有重要参考价值。我们继续将上述剂量体外照射的造血干细胞与G-CSF联合用于超大致死量10Gy辐射损伤小鼠的救治。结果发现,7.5Gy照射造血干细胞+G-CSF组、G-CSF组以及对照组小鼠全部死亡,而5Gy照射造血干细胞+G-CSF组小鼠存活率达到60%,造血快速恢复,但5Gy照射供者造血干细胞在受者小鼠体内形成高比例稳定嵌合,快速的造血恢复来源于供者细胞的完全植入取代受者造血,而并非受者自身造血恢复,因此导致部分小鼠发生慢性GVHD死亡,提示在受者小鼠无残存自身造血的情况下,体外照射的造血干细胞治疗可能存在的风险。在第一部分中我们还就照射后造血干细胞体外增殖能力、体内归巢以及其支持造血的机理进行了初步研究,并在正文中对造血干细胞体外灭活程度、受者免疫抑制程度、供者细胞植入比例与GVHD发生关系进行了详细分析。在第二部分的研究中,我们选取在第一部分中能够起到良好造血促进作用的5Gy照射供者造血干细胞与G-CSF联合方案,观察其对6Gy亚致死量辐射损伤小鼠免疫功能的影响。结果提示联合治疗能够调整辐射损伤小鼠中枢及外周淋巴细胞亚群的比例,促进淋巴细胞功能恢复。G-CSF联合细胞输注后可促进胸腺双阴性细胞的增殖、分化,减轻双阳性细胞凋亡,促进其向CD4、CD8单阳性细胞分化,提高外周血淋巴细胞绝对值,以及CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞比例,增强T、B淋巴细胞对丝裂原的反应。利用实时定量PCR对胸腺TRECs水平检测我们发现照后30d、60d,G-CSF联合细胞输注组TRECs拷贝数明显高于对照组及单独使用G-CSF组,流式细胞仪检测受者小鼠外周初始T细胞水平发现联合治疗组外周血中初始T细胞水平明显增高,提示联合治疗可增加胸腺近期输出功能,促进辐射损伤后中枢免疫功能重建。通过上述实验研究,我们发现G-CSF联合体外一定剂量照射后半相合异基因造血干细胞输注能够促进亚致死量及有极少残存造血的致死量辐射损伤小鼠自身造血及免疫功能恢复,无GVHD等副反应发生,为ARS的细胞治疗提供了一条新思路、新方法。