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高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是一大类高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白,不仅广泛存在于真核细胞的细胞核内,对DNA复制、转录、重组和修复具有重要作用,而且可作为一种新的“晚期”炎症介质由单核/巨噬细胞分泌到细胞外参与炎症反应。新近研究表明,HMGB1不仅与机体的炎症反应密切相关,还可以作为一种免疫调节因子引起淋巴细胞激活并释放白介素(IL)-2,诱导树突状细胞活化并分泌IL-12。而且,我们前期实验证实,在小鼠淋巴细胞内加入重组HMGB1可引起淋巴细胞大量凋亡,并可影响活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)的入核启动基因转录,IL-2水平亦受到影响。但是,目前HMGB1以何种机制影响T淋巴细胞合成释放IL-2还不明确,其中的确切信号转导途径尚缺乏研究。已证实,NFAT家族是淋巴细胞内免疫应答的主要信号通路。NFAT受T淋巴细胞受体(TCR)信号活化后,转位入核内调控重要基因转录表达。NFATs家族已发现有5个成员,包括NFAT1(NFATp,NFATc2)、NFAT2(NFATc1,NFATc)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3,NFATx)及NFAT5(TonEBP,tonicity element binding protein,紧张片断结合蛋白)。NFAT1-4是由钙调节的,与细胞的免疫调节反应关系密切;NFAT5相对原始,是NFATs家族中唯一可在果蝇基因组中找到的。研究表明,成熟的T淋巴细胞主要表达NFAT1、NFAT2,是影响IL-2合成释放的关键转录因子。因此,HMGB1有可能通过与NFAT1或NFAT2蛋白的相互作用进一步影响IL-2的合成释放。本实验拟构建HMGB1与NFAT2的真核表达质粒,验证二者是否存在协同效应?并通过促进IL-2报告基因的表达水平分析,进一步检测二者之间的相互结合作用;此外,初步探讨二者之间的相互作用位点,反过来再次验证其确切相互作用。该研究旨在从信号转导水平初步了解HMGB1影响IL-2表达释放的分子机制,丰富脓毒症时机体免疫调节异常改变的认识,为脓毒症的有效干预和防治提供新思路。本实验采用PCR、co-IP、Western-blot、GST-pull down及sRNAi的方法首先证实了HMGB1与NFAT2之间的确存在相互协同作用,可显著提高IL-2报告基因的表达活性。然后在此基础之上,观察了二者在体外和细胞内的相互直接结合作用,并初步明确了HMGB1与NFAT2结合的具体位点。为将来设计位点干扰的免疫调节药物奠定了良好基础。主要结果和结论如下:1.HMGB1可与NFAT2协同促进IL-2表达,二者协同促进报告基因活性上升的倍数远大于二者单独作用时倍数之和。2.IL-2报告基因活性得到充分提高必须依赖于HMGB1和NFAT2共同作用,二者缺一不可。逐步增加HMGB1转染量,可剂量依赖性增强报告基因的活性。应用sRNAi技术抑制二者任一方都可使IL-2报告基因活性下降。3.HMGB1和NFAT2之间存在直接的相互作用,应用GST-pull down实验及co-IP实验证实二者在细胞外和细胞内都可以直接相互结合。4.初步明确HMGB1是通过B box与NFAT2相互结合,而A box不能与NFAT2在体外结合。