背景:终末期肝病是一种由多种因素如病毒感染等引起的进行性不可逆的肝脏损伤,最终将发展至肝功能显著减退乃至肝衰竭。迄今为止,终末期肝病治疗效果最好的方法仍然是进行肝移植,但肝移植的临床应用却面临着诸多局限,比如昂贵的费用,长期服用免疫抑制剂伴随的副作用,以及目前器官移植的最大瓶颈——供肝来源有限。因此,开发出能够代替传统器官移植治疗终末期肝病的新疗法已经成为亟需解决的问题。干细胞(stem cell)是一种能够维持自我更新的状态、保持高度增殖能力、具有向任何机体组织、器官细胞分化的潜能,并保持自身不发生分化的一类细胞。理论上,干细胞能够分化为任何组织细胞,因此利用自身干细胞衍生的组织或器官替代病变的组织和器官已成为器官移植、再生医学等领域最有希望的新型治疗手段。与传统肝脏移植手术不同的是,干细胞移植治疗终末期肝病具有治疗花费少、取材途径多样并且没有免疫排斥反应等优点。目前已有多项研究表明,胚胎干细胞、间充质干细胞以及诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)均能在体外经特定因子刺激下定向分化为具有糖原合成、药物代谢等成熟肝细胞功能的肝样细胞。近年,我们已经成功从人毛囊组织中分离出人毛囊间充质干细胞(hair follicle mesenchymal stem cell,HF-MSC),并利用慢病毒将Yamanaka四因子导入HF-MSC中,在国内外首次成功构建了人毛嚢间充质源性i PS细胞(HF-iPSC)。具备全向分化潜能的HF-iPSC一方面能够利用HF-MSC无需手术等优点,另一方面可维持其未分化状态,长时间进行体外培养时HF-iPSC的基因组具有更好的稳定性。目前,尚未有相关实验验证HF-iPSC是否能在体外成功分化为具有成熟肝细胞功能的诱导性肝细胞(induced hepatocyte-like cell,i Hep)。另外,虽然研究显示通过直接移植干细胞或由干细胞体外诱导获得的肝细胞来治疗终末期肝病在一定程度上能够改善肝功能以及延长终末期肝病模型小鼠的生存时间,但植入的干细胞或诱导性肝细胞究竟如何在病理环境下分化、增殖和发挥功能却并不十分明确。因此,针对在终末期肝病中普遍存在的低氧微环境,系统研究干细胞在低氧环境下的分化、增殖等过程将为我们更明确的掌握移植细胞对体内低氧微环境的应答、更有效的发挥移植干细胞的修复功能提供理论基础。目的:本研究以人毛嚢间充质源性iPSC为种子细胞,探讨在体外诱导HF-iPSC向功能性肝细胞分化的可能性,以期在对终末期肝病进行细胞治疗的干细胞种子库中再添加一个新的选择。同时,针对在终末期肝病中普遍存在的低氧环境,我们研究低氧培养对HF-iPSC分化能力的影响,这为我们进一步明确如何在低氧环境下更有效的发挥干细胞的修复功能提供理论基础。方法:本研究采用“定型内胚层-肝脏特化-肝祖细胞增殖-肝细胞成熟”4阶段诱导方案,通过在肝细胞发育的各个阶段中添加不同类型的刺激因子诱导HF-iPSC在体外分化为肝细胞;通过免疫荧光染色和实时荧光定量PCR方法对干细胞多能性基因、分化相关的标志性基因和肝细胞特异性基因进行鉴定并应用基因芯片技术对诱导细胞的基因表达情况进行分析;同时,我们还对获得的诱导性肝细胞进行了糖原摄取、药物代谢等功能方面相关的验证。结果:1.HF-iPSC经体外20天诱导分化后,获得的诱导性肝细胞能够表达白蛋白(albumin,ALB)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、CYP450家族中的CYP3A4、CYP7A1等肝细胞特异表达的基因,并具有糖原摄取等成熟肝细胞功能。2.短暂低氧诱导能够显著上调定型内胚层的标志性基因SOX17(SRY-Box 17)、GATA4(GATA-binding Protein 4)和Fox A2(Forkhead box A2)的表达,下调多能性相关基因SOX2、OCT4的表达;长期低氧诱导时,SOX17、GATA4和Fox A2表达水平也上升,但较短暂低氧组表达水平偏低,并且干细胞多能性相关基因SOX2和OCT4表达呈上升趋势。结论:1.人毛囊间充质源性iPSC可通过在不同肝分化阶段添加不同的刺激因子成功在体外获得具有糖原摄取、低密度脂蛋白摄取等成熟肝细胞功能的诱导性肝细胞,这使HF-iPSC成为有希望治疗终末期肝病的干细胞库中的一个新成员,为应用HF-iPSC进行再生医学探索及疾病的个体化治疗奠定理论基础。2.短暂低氧能够促进HF-iPSC向定型内胚层分化,而长期低氧则对HF-iPSC的分化能力有一定抑制作用。明确短暂低氧和长期低氧对干细胞分化的作用差异将对我们提高干细胞分化效率以及探讨如何更有效的使干细胞在低氧环境下发挥肝脏修复功能有重要意义。