尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)，为联合国粮农组织向世界各国推荐的养殖对象，现已成为中国重要的养殖鱼类品种。但近年来养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致罗非鱼的大量死亡，威胁着我国罗非鱼养殖业的健康发展，因此很有必要开展罗非鱼免疫防御机制的研究。γ-干扰素是调控天然免疫和细胞免疫的一种重要的细胞因子，除了具有抗病毒作用外，干扰素还参与到其他重要的生理反应中，如调节细胞的生长、分化、凋亡及免疫反应等，近年的研究发现干扰素中的γ-干扰素还具有显著的抗菌作用。本研究克隆了尼罗罗非鱼γ-干扰素基因，实时定量PCR检测了其在无乳链球菌感染前后各组织和器官中的表达，以了解γ-干扰素基因在尼罗罗非鱼免疫防御过程中的作用；同时以斑马鱼作为转基因研究模型，评估金鱼Tgf2转座子系统在转基因鱼研制上应用的可行性，并应用于构建转基因罗非鱼。主要研究内容如下：1.尼罗罗非鱼γ-干扰素基因的克隆与表达特性分析。本研究从尼罗罗非鱼脾脏组织中扩增到γ-干扰素基因的cDNA，其大小为690bp，开放阅读框为621bp，推测编码206个氨基酸。生物信息学分析表明，尼罗罗非鱼γ-干扰素分子包含1个信号肽和1个核定位信号。其二级结构复杂，含有10个α-螺旋、13个β-折叠，具有较强的亲水性。同源性分析显示，其与斜带石斑鱼γ-干扰素相似性最高（61.5%）。实时荧光定量PCR检测正常尼罗罗非鱼个体γ-干扰素基因在不同组织中的表达，结果表明该基因在脾脏中表达量最高，其次是肠、鳃和肾脏，在心脏、肌肉和皮肤组织中的表达量则较低。感染无乳链球菌后，尼罗罗非鱼γ-干扰素基因在脾脏、皮肤、肾和鳃中的表达均显著上调。推测尼罗罗非鱼γ-干扰素参与鱼体对病原菌的防御过程，在免疫反应中发挥重要作用。同时应用原核表达系统制备尼罗罗非鱼γ-干扰素重组融合蛋白，为进一步了解其功能奠定基础。2. Tgf2转座系统在转RFP基因斑马鱼上的应用。本研究利用近年开发的金鱼转座子系统进行转基因斑马鱼的研制，探讨其在转基因鱼上应用的可行性。通过PCR手段，改造转座子供体质粒pTgf2-EF1α-eGFP，将肌球蛋白轻链2启动子(mylz2)与红色荧光蛋白基因(RFP)定向插入其中，构建红色荧光蛋白基因肌肉组织特异性表达供体质粒pTgf2-Mylz2-RFP。通过显微注射，将转座子供体质粒与转座酶mRNA共注射于斑马鱼受精卵中，共注射受精卵972粒，仔鱼出膜803尾，其中携带外源基因的仔鱼615尾，阳性率为76.6%。转红色荧光蛋白基因斑马鱼的F0代培育至性成熟，将10尾F0代斑马鱼与野生型斑马鱼配对繁殖，其中1个组合产生了体表呈现均匀红色荧光的F1个体，RFP在F0代的整合率为10%。将红色荧光F1个体培育至性成熟并与野生型鱼配对繁殖，F2代的阳性个体占69%。本研究结果说明由Tgf2转座子介导的转基因技术,可有效提高目的基因的转植效率与整合效率，在转基因鱼构建以及相关研究中具有开发应用前景。3.尼罗罗非鱼γ-干扰素基因转基因元件的构建及在斑马鱼中的转植。定向改造金鱼Tgf2转座子供体质粒pTgf2-hsp70-eGFP，用尼罗罗非鱼γ-干扰素基因替换GFP基因，构建由hsp70启动子驱动的γ-干扰素基因Tgf2转座子供体质粒pTgf2-hsp70-γIFN。通过显微注射，将转座子供体质粒与转座酶mRNA共注射于斑马鱼受精卵中，共注射受精卵3000粒，仔鱼出膜1480粒。转基因斑马鱼F0代培育至性成熟后，与野生型鱼配对繁殖，首批8尾转基因鱼中有2尾获得F1阳性个体，可遗传率为25%。本研究为进一步分析转γ-干扰素基因斑马鱼的抗病力以及开展转基因抗病罗非鱼的构建奠定基础。