研究目的：乙型肝炎病毒的感染(CHB)是严重威胁我国人类健康的重大传染病,其迁延不愈的特点不仅给患者和社会带来沉重的负担,也对公共卫生产生巨大隐患。Ⅰ型干扰素是目前治疗CHB和相关疾病最常用的药物,然而仅对约1/3的患者有效,且容易产生耐药性,大大限制了其临床治疗效果,这种现象在临床上称为“干扰素抵抗”。产生这一现象的主要原因是,HBV感染后机体免疫平衡被破坏,造成免疫功能低下或者紊乱。研究表明,HBV病毒可以在分子、细胞、器官和个体等多个层次上对机体抗病毒天然免疫和获得性免疫产生抑制和耐受,这是造成HBV感染容易慢性化的分子免疫基础。肝脏免疫学认为,抑制进而完全清除HBV离不开机体抗病毒免疫反应的激活,而正常的免疫功能也是药物治疗取得理想疗效不可或缺的因素。然而,目前以针对“干扰素抵抗”为代表的HBV负向免疫调节作用的研究相对滞后,限制了抗HBV免疫治疗药物的开发。miRNA是近年来发现的一类主要在转录后水平上对基因表达进行调节的短片段非编码RNA。在哺乳动物细胞内,miRNA可通过序列特异性的不完全互补作用抑制靶基因mRNA的翻译。研究发现,miRNA在抗病毒天然免疫反应中,既可以成为典型的基因调控因子,也能够成为直接靶向转录物而发挥干扰作用的免疫效应分子。同时,在HBV的致病过程中,宿主miRNA同样参与了病毒复制、转录、包装等自身生命活动,通过调控宿主基因参与了炎症反应、免疫损伤、促进自身潜伏、诱发继发性疾病乃至肝癌,成为研究HBV与宿主相互作用的重要窗口。本研究的目的是通过对HBV存在条件下肝细胞内miRNA表达水平的检测和筛选,寻找可能参与HBV诱导胞内天然免疫抑制,特别是“干扰素抵抗”的miRNA。通过干预miRNA的表达水平,分析相关miRNA与HBV感染之间的关系,并研究其是否参与了HBV造成的肝细胞胞内抗病毒免疫应答信号的调节,探究其与“干扰素抵抗”是否相关。利用生物信息学和分子生物学的手段鉴定在这一过程中miRNA发挥作用的关键靶分子,并寻找HBV感染与相关分子之间动态水平的关联。最后,利用HBV复制性小鼠模型，研究靶向于预特定miRNA能否改变HBV的体内感染过程,为开发基于miRNA的新型抗HBV免疫药物提供理论和实验依据。研究方法：首先,以整合了HBV全基因组的HepG2.2.15细胞和无HBV存在的对照细胞HepG2为模型,利用miRNA特异性RT和qPCR两种技术,我们定量分析了细胞内与免疫相关的15种niRNA的丰度,观察了HBV感染对肝细胞内免疫相关miRNA的调节作用,发现miR146家族的两个成员,特别足miR146a在HBV整合的肝细胞系内的表达明显高于对照细胞,并通过核糖核酸酶保护实验确认了miR146a在两种细胞系内的绝对水平;在HepG2.2.15细胞和HepG2细胞中,利用特异性引物并通过RT-qPCR定量分析：niR146a初级转录物和次级前体的表达,并采用荧光素酶报告基因实验分析两种细胞中miR146a启动子的活性。其次,通过基因工程的方法,我们构建了HBV全基因组和四种主要蛋白元件的真核表达载体，并分别将其转染到HepG2细胞中,利用RT-qPCR技术检测了HBV基因组及其蛋白组分的存在对肝细胞内miR146a表达的影响。同时,我们利用HBV全基因组表达载体尾静脉高压注射的方法建立了HBV复制性小鼠模型,通过灌流法分离小鼠肝实质细胞,接着用RT-qPCR法检测了其中miR146a的表达,同时用ELISA法检测了小鼠血清中HBsAg的水平,分析了二者之间的关系,并再次确认了HBV存在对(?)niR146a表达水平的影响。接下来,我们将化学合成的miR146a抑制物转染入高表达miR146a的HepG2.2.15细胞,利用RT-qPCR和ELISA检测其对HBV转录和抗原表达的影响。与此同时,将miR146a模拟物或其过表达载体与HBV全基因组载体联合转染低表达miR146a的HepG2细胞,检测了其对HBV转求和抗原表达的影响。为进行体内研究,我们构建了靶向miR146a家族成员的niR146a sponge沉默载体与miR146a过表达载体pcDNA3-miR146a,然后分别与HBV全基因组载体配伍,联合高压注射小鼠,ELISA检测小鼠血清HBsAg和HBeAg的含量,并用免疫组织化学分析小鼠肝组织HBsAg和HBcAg的表达,探索了体内靶向干预肝细胞内miR146a的表达水平后对HBV体内感染周期的影响。在分析miR146a对Ⅰ型干扰素信号转导通路影响研究中,首先对miR146a进行干预,然后再进行Ⅰ型干扰素处理,利用RT-qPCR和Western Blotting技术比较干预前后细胞中MxA、ISG15、OAS-1、IFIT3等主要抗病毒基因的转录和蛋白表达水平；在先期相关研究的基础上,比较了两种细胞miR146a靶基因-转录因子STAT1的表达：构建了包含miR146a识别区域的UTR的荧光素酶报告基因载体,并用于评价靶基因翻译活性。采用荧光素酶报告基因实验,我们分析了STAT1发生差异表达的分子基础；在此基础上,利用miR146a过表达和沉默策略,检测了肝细胞中miR146a调控STAT1表达的机制,并通过改变肝细胞内miR146a的水平,分析了miR146a对STAT1翻译活性的调节作用。通过对HBV阳性和阴性肝细胞癌临床标本的分析,我们进一步确认了STAT1的表达与HBV感染之间存在相关性。最后,通过生物信息学手段,我们分析了可能参与抗HBV天然免疫应答过程的17种干扰素诱导基因与miR146a之间的关系,其中有三个基因被预测可能成为miR146a的直接靶点。我们构建了针对IFIT3的UTR区荧光素酶报告基因载体,证实了IFIT3是miR146a的一个新的直接靶点。在两种模型细胞中,我们比较了该基因和已知miR146a靶基因TRAF6翻译活性与miR146a表达水平之间的关系。基于已知的IFIT3和TRAF6生物学功能,我们又通过体外转录合成了RLR信号通路的配基5’ppp-RNA(简称3p-RNA)。首先通过预先沉默(?)niR146a的方法,利用RT-qPCR分析了肝细胞对3p-RNA免疫刺激作用的敏感性；接着进行IFIT3过表达实验,利用RT-qPCR和ELISA方法,分析其对肝细胞3p-RNA刺激的正向作用和直接抗HBV活性；通过荧光素酶报告基因实验分析了miR146a对肝细胞内TRAF6翻译的调节作用。研究结果：1.肝癌细胞内miR146a的高表达与HBV感染密切相关HBV感染造成了多种免疫相关miRNA的表达水平发生变化,其中以miR146家族最为明显；在整合有HBV的肝癌细胞系HepG2.2.15和PLC/PRF/5中,miR146a的表达水平明显高于无HBV存在的阴性细胞系；HepG2.2.15中miR146a初级转录本和颈环前体的表达也明显高于对照细胞HepG2; HBV感染引起miR146a上调依赖于NF-κB。2.HBV感染引起了肝细胞内miR146a表达水平的升高我们成功建立HBV完整基因组和四个主要蛋白成分X蛋白、核心蛋白、表面抗原小蛋白和HBV的DNA多聚酶的真核表达载体；瞬时转染HBV全基因组载体后,HepG2细胞中(?)niR146a的表达水平明显提高,并且HBV基因组表达载体稳定化的HepG2细胞地也有相同的现象;HBV的四个主要的蛋白产物对上调肝细胞miR146a的表达有共同但不均等的贡献;在HBV复制性小鼠中,小鼠原代肝实质细胞内miR146a的表达与血清HBsAg的表达水平呈一定程度的正相关。3. miR146a可以促进HBV的复制和转录流式细胞术结果证实,荧光标记的miR146a模拟物和阻遏物可以有效的导入靶细胞。定量PCR检测结果发现,它们均可以有效地改变肝细胞内源性miRNA的表达水平;我们自行设计结构的miR146a sponge载体也可以有效地沉默HepG2.2.15细胞内miR146a的水平：在上述实验系统的支撑下,在HepG2细胞模型中,进行模拟物或者质粒载体过表达miR146a,可以促进瞬转HBV的转录,而通过阻遏物或者质粒载体沉默niR146则可以抑制HBV的转录和翻译。通过尾静脉高压注射的的方式向小鼠肝脏输送miR146a过表达载体,可以升高小鼠血清HBsAg和HBeAg抗原的表达水平和肝细胞内HBsAg的表达,而输送靶向miR146a的sponge沉默载体后,小鼠血清HBsAg和HBeAg抗原的含量明显降低,且肝细胞内HBsAg的表达亦显著下降。同时,抑制miR146a的水平不影响(?)AepG2.2.15细胞的增殖;miR146b模拟物和HBV全基因组载体共转染HepG2细胞并不能明显影响HBV的转录,miR146b模拟物转染也未影响HepG2.2.15细胞分泌HBV抗原的能力。基于RNA二级结构稳定性和保守性的生物信息学预测认为,miR146a不会直接靶向HBV RNA。4. miR146a可以抑制肝细胞内Ⅰ型干扰素的信号转导将miR146a模拟物转染入HepG2细胞后,可以抑制细胞对后续IFN-α刺激的应答,表现为ISG15、MxA、OAS-1、IFIT3等干扰素诱导基因转录的减弱和蛋白合成的下降。在miR146a稳定过表达的HepG2细胞上,也可以观察到类似的现象;而将miR146a阻遏物转染入HepG2.2.15细胞后,则会产生相反的作用,表现为ISG15、MxA、OAS-1、IFIT3等干扰素诱导基因转录的增强和蛋白合成的增加。5.HBV感染诱导的miR146a的高表达抑制了肝细胞内STAT1的水平HepG2.2.15细胞中STAT1的基础表达水平低于HepG2;与临床HBV阴性肝细胞癌细胞相比,HBV阳性肝细胞癌细胞中STAT1的水平明显降低；将rniR146a阻遏物转染入HepG2.2.15细胞后,可以明显上调STAT1蛋白的表达,而不影响胞内mRNA的水平,而转染miR146a的模拟物则会产生相反的结果。报告基因检测显示,HepG2.2.15细胞中STAT1的基础翻译水平明显低于HepG2细胞,这可能是其蛋白表达低于HepG2勺原因之一；提高HepG2细胞内miR146a勺水平可以序列依赖性地抑制STAT1的翻译,而抑制HepG2.215细胞内miR146a的水平则能够序列依赖性地促进STAT1的翻译。6.人IFIT3基因是miR146a的一个新的直接靶基因利用四种生物信息学软件,我们对17种抗HBV宿主基因与miR146a关系进行分析,其中有三个基因可能成为rniR146a的直接靶基因,分别是IFIT3、RIG-I和RNase L:针对IFIT3的荧光素酶报告实验证实,IFIT3是：miR146a的直接靶基因。HepG2.2.15细胞中IFIT3基因的基础翻译水平低于HepG2细胞,且与STAT1的转录后调节相似,HepG2.2.15细胞中IFIT3基因的翻译水平受到胞内miR146a的抑制,向HepG2.2.15细胞内转染miR146a抑制物能够序列依赖性地促进IFIT3的翻译。7. miR146a抑制了肝细胞内5’ppp-RNA刺激对I型干扰素的诱导作用向HepG2.2.15细胞内转染miR146a抑制物后,5’ppp-RNA对HepG2.2.15细胞的免疫刺激作用显著增强,促进内源性Ⅰ型干扰素的诱导表达;在HepG2.2.15细胞内过表达IFIT3后,同样可以促进5’ppp-RNA引起的Ⅰ型干扰素的诱生。另一种参与天然免疫应答并诱导Ⅰ型干扰素分子TRAF6,也受到miR-146a的转录后抑制,其在HepG2.2.15细胞中的翻译明显低于HepG2细胞。这可能是miR146a通过转录后抑制方式参与HBV感染肝细胞后内源性Ⅰ型干扰素诱导的新的分子机制。将IFIT3过表达载体转入HepG2.2.15后,胞内HBV mRNA的转求水平显著受到明显抑制,提示IFIT3可能具有直接的抗HBV活性。结论：1.HBV基因组织的肝细胞系HepG2.2.15中miR146a的表达水平显著高于(?)AepG2细胞,主要分子机制是转求活性增强。2. miR146a的存在促进了HBV的生命活动和自身存续,生物信息学预测显示这种左右很可能不是通过直接与病毒RNA相互作用实现的。3. miR146a通过对靶基因STAT1翻译的抑制,负调了肝细胞对Ⅰ型干扰素诱导的抗病毒反应的应答能力,而抑制miR146a的功能则可以提高Ⅰ型干扰素体内外抗病毒效果。4.人IFIT3是miR146a的直接的靶基因之一,且可能具有直接的抗HBV作用。5. miR146a通过对靶基因IFIT3和TRAF6翻译的抑制,负调5’ppp-RNA对肝细胞内源Ⅰ型干扰素的诱导,而抑制miR146a的功能可以增强5’ppp-RNA的刺激作用,促进Ⅰ型干扰索的转录和表达。意义：miR146a高表达是HBV感染改变肝细胞表现遗传状态的主要表现之一;它通过调控多种与内源性Ⅰ型干扰素诱导和激活有关的信号分子,对胞内抗病毒天然免疫产生钝化作用,而有利于HBV的存续；靶向沉默miR146a则能够打破HBV感染造成的肝脏免疫抑制状态,促进HBV的清除,而针对miR-146a的阻遏分子则有望开发成为可以有效逆转“干扰索抵抗”,提高干扰素临床抗HBV疗效的免疫增强药物。