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【背景】肝细胞肝癌(HCC,以下简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一,严重危害国人的健康。我国肝癌的主要病因为乙型肝炎病毒(HBV)的长期慢性感染,并且HBV X开放读框编码的乙肝病毒X蛋白(HBx)在肝癌的发生发展中起着重要作用。HBx具有转录激活子功能,调节细胞中许多与细胞凋亡和周期相关的基因的表达;HBx能调节胞浆中的多种信号转导途径;HBx能影响DNA修复。但上述这些机制只能部分解释HBx在HBV诱导肝癌发生发展中的作用。HBx发挥作用的机制还存在许多不明之处。为了进一步寻找HBx发挥作用的其它分子,我们课题组运用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术(RACE-PCR)克隆出了一个可以被HBx蛋白上调新基因URG4(Upregulated gene 4),该基因全长3607bp,编码104 KD的蛋白。经NIH人类基因组数据库比较,此基因定位在人类7号染色体,无同源基因。蛋白质综合信息库分析(SWISS PROT),此蛋白具有一个穿膜螺旋( Transmembrane helices: 336-353 );三个核内信号定位肽(Nuclear localization signals: PYRGKRN 380、PRPRDKR 821、PRDKRQL 823);一个ATP/GTP结合区(ATP/GTP binding site 690-697 GVPGTGKS),与caspase修复成员6(caspase recruitment domain family 6)在88-461氨基酸之间有34%同源。初步研究发现此基因不仅可以促进肿瘤细胞生长,还可促进肿瘤细胞在体内的成瘤性,为又一新的促癌基因。但其发挥作用的分子机制还不清楚。【目的】1、检测URG4在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达及意义。2、探讨URG4与HBx在肝癌组织及细胞中表达之间的关系。3、检测URG4对肝癌细胞生长的影响及相关机制。【方法】1、免疫组化方法检测URG4和HBx在正常组织、肝癌组织及癌旁组织中的表达分布,并分析其表达的意义及表达之间的相关性。2、RT-PCR和Western blot检测肝癌细胞系(HHCC、HepG2和SMMC-7721)、永生化肝细胞QZG及转染HBx基因的肝癌细胞中URG4的mRNA及蛋白的表达。3、脂质体法将URG4基因的真核表达载体转入QZG细胞,将URG4特异SiRNA载体转染入肝癌HepG2细胞中,G418筛选稳定表达的单集落。4、MTT法绘制转染细胞及其对照细胞的生长曲线。5、流式细胞仪分析转染细胞及其对照细胞的细胞周期分布。6、平板集落形成实验检测转染细胞及对照细胞的集落形成能力。7、软琼脂集落形成实验检测URG4表达抑制后,肝癌细胞的体外成瘤能力的变化。8、Western blot和RT-PCR检测转染细胞和对照细胞周期相关分子cyclinD1的变化。【结果】1、URG4在肝癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达100例肝癌标本中,48例URG4阳性表达,阳性表达率为48%;癌旁组织中URG4阳性表达54例(54%),并且URG4主要表达在肝硬化组织中;在27例正常组织中,仅6例弱表达URG4,阳性率22.2%。同时在肝癌细胞系HHCC、HepG2和SMMC-7721中可检测到不同程度的URG4 mRNA及蛋白的表达,以HepG2细胞中表达最高,但在永生化肝细胞QZG中没有检测到URG4的表达。URG4在肝癌和癌旁肝硬化组织中的表达高于正常组织,在肝癌细胞系中的表达也高于永生化细胞。2、HBx在肝癌组织和癌旁组织中的表达及其与URG4表达的关系肝癌细胞中HBx几乎全部表达于细胞质中,偶见部分核染色。78例乙肝相关性肝癌标本中,60例HBx阳性表达,阳性表达率为76.9%;癌旁组织中HBx阳性表达65例(83.3%),并且HBx也主要表达在肝硬化组织中;在27例正常组织中,没有检测到HBx的表达。相关性分析发现肝癌组织中HBx和URG4表达的相关系数0.38(P<0.05),并且在肝癌癌旁组织中的相关系数0.45(P<0.05)。HBx基因稳定转染的HepG2细胞中,URG4 mRNA和蛋白表达水平均上调。3、URG4对肝癌细胞生长的影响将URG4正义载体转染入QZG细胞后,发现QZG细胞生长加快,由G1期进入S期的细胞比例增加;将URG4-siRNA转染入肝癌细胞HepG2后,HepG2细胞的生长显著减慢,锚定非依赖性生长的能力、单细胞集落形成能力以及裸鼠体内成瘤能力均显著减弱,并且细胞细胞由G1期进入S期比例显著下降。4、URG4调节肝癌细胞生长的相关机制URG4表达上调后,周期相关分子cyclinD1表达增加;URG4表达抑制后,cyclinD1表达下降。【结论】1、URG4在肝癌的发生中起着重要的作用,其表达可能主要受HBx调节。2、URG4可以通过调节细胞周期的关键分子cyclinD1的表达而影响肝癌细胞的生长、细胞周期及体外成瘤能力。