第一部分促红细胞生成素Dynepo对肾小管上皮细胞及慢性肾功能衰竭大鼠的保护性作用研究促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)主要由胎儿肝脏和成人肾脏产生,能特异性地作用于哺乳动物红系祖细胞,促进其增殖、分化并抑制其凋亡。自人工合成以来一直用于治疗各种疾病导致的贫血,尤其是肾性贫血。许多研究证实EPO具有产生的多源性、受体的广泛存在性及作用的多效性等特点。近年来EPO的细胞保护和器官保护作用备受世人瞩目。肾脏是EPO的主要产生部位,且EPO及其受体在肾缺血再灌注损伤及其它毒性物质造成肾脏损伤时表达上调,暗示EPO具有内源性肾脏保护作用。本部分应用现代分子生物学和细胞生物学方法研究新型促红细胞生成素Dynepo在原代人肾小管上皮细胞中的抗氧化应激作用及对慢性肾衰竭大鼠的保护性作用,并初步探讨其作用机制。第一章Dynapo对原代肾小管上皮细胞的保护作用及机制研究研究目的探讨新型促红细胞生成素Dynepo对原代人肾小管上皮细胞(phRTE cell)的保护性作用及其机制,为临床验证Dynepo的肾脏保护作用提供线索和理论依据。研究方法1.从肾癌患者肾切除术中获取部分正常肾组织,无菌条件下分离并体外培养人肾小管上皮细胞,加入不同浓度的葡萄糖氧化酶(GO)诱导氧化应激细胞模型,检测诱导氧化应激后60min、120min、180min和240min细胞内活性氧水平、细胞形态改变、细胞死亡率及细胞外LDH水平估测细胞膜完整性,以加入GO前细胞的检测值作为对照。2.将不同浓度Dynepo与细胞同孵育或预孵育,然后检测GO诱导氧化应激后60min、120min、180min和240min细胞内活性氧水平、细胞形态改变、细胞死亡率及细胞膜完整性。3.将不同表型的EPO(Dynepo和Eprex)与细胞共孵育或预孵育,然后检测GO诱导氧化应激后60min、120min、180min和240min细胞内活性氧水平、细胞形态改变、细胞死亡率及细胞膜完整性,以研究不同EPO的细胞保护性作用的差异。4.在加入Dynepo与细胞预孵育的同时加入游离型EPO-R,然后检测GO诱导氧化应激后60min、120min、180min和240min细胞内活性氧水平、细胞形态改变、细胞死亡率及细胞膜完整性,验证Dynepo是否通过与细胞膜表面的EPO-R结合发挥抗氧化应激及细胞保护作用。5.免疫荧光法检测加入Dynepo前及加入后6h、12h、18h和24h细胞EPO-R表达水平及表达部位的变化。6.荧光实时定量PCR技术检测诱导氧化应激后有无Dynepo预孵育的phRTE细胞组在不同时间点(30min、60min、120min、180min和240min)Bcl-2、HO-1、CPM、DPP4、Cygb氧化应激相关基因的表达变化。结果1.GO在phRTE细胞内诱导时间依赖性氧化应激反应,且GO浓度与细胞内活性氧水平、细胞死亡率及细胞外液LDH活性呈正相关。2.Dynepo具有降低phRTE细胞内活性氧水平、降低细胞死亡率及保护细胞膜稳定性的作用,且上述作用随着Dynepo浓度的升高而增强。Dynepo和Eprex抗氧化应激作用相似,与细胞孵育24h后Dynepo细胞保护作用增强。3.Dynepo可诱导EPO-R表达,随着诱导时间的延长EPO-R由细胞核内逐渐转移至细胞浆,最后表达在细胞膜。4.游离型EPO-R可阻断Dynepo的细胞保护作用。5.Dynepo可以调控氧化应激细胞模型内Bcl-2和HO-1、CPM、DPP4、Cygb基因的表达,且上述基因表达的升高与Dynepo降低phRTE细胞内活性氧水平、降低细胞死亡率及保护细胞膜稳定性作用同时存在。结论GO可在phRTE细胞内诱导剂量、时间依赖性氧化应激反应,Dynepo具有降低细胞内活性氧水平、保护细胞膜稳定性及降低细胞死亡率作用,这种作用可能是通过诱导EPO-R表达于细胞膜表面并与其结合,调节Bcl-2和HO-1、CPM、DPP4、Cygb基因的表达而发挥降低细胞内活性氧水平、保护细胞膜完整性、降低细胞死亡率的作用。但Dynepo诱导EPO-R表达的机制仍需进一步研究阐明。第二章Dynepo对慢性肾功能衰竭大鼠的保护性作用研究研究目的探讨Dynepo对慢性肾功能衰竭大鼠的保护性作用,为其临床应用提供进一步的理论基础和实验依据。研究方法1.将大鼠随机分为假手术组、单纯CRF组、CRF+Dynepo100组和CRF+Dynepo10组四组。假手术组,大鼠经历开腹等手术操作,但不进行肾脏切除;单纯CRF组,5/6肾切除建立慢性肾功能衰竭模型。假手术组和单纯CRF组均不加用任何药物干预,每周三次0.4ml生理盐水尾静脉注射。CRF+Dynepo100组,5/6肾切除建立慢性肾功能衰竭模型,每周三次尾静脉注射Dynepo溶液(100U/kg)0.4ml;CRF+Dynepo10组,5/6肾切除建立慢性肾功能衰竭模型,每周三次尾静脉注射Dynepo溶液(10IU/kg)0.4ml。2.每天观察大鼠一般情况、精神状态并每周测量一次各组大鼠体重、食量和血压。3.每四周取大鼠动脉血一次测血气分析各指标、取静脉血测各组大鼠。肾功能指标(血肌酐、尿素氮、血钾等)、血常规(白细胞、血小板、红细胞、血红蛋白、网织红计数等)、血浆白蛋白、血钙磷水平、血清氧化应激水平等。4.每四周收集一次大鼠尿液,统计尿量、测尿肌酐、尿钙磷排泄率等。5.每周统计各组大鼠死亡率。结果1.5/6肾切除后一个月大鼠血肌酐、尿素氮和24小时尿蛋白水平持续上升,肌酐清除率持续下降,CRF大鼠造模成功。2.营养状况:单纯CRF组大鼠一般状况较差,体重增加缓慢,血浆白蛋白水平持续下降,Dynepo干预可改善CRF大鼠一般状况及营养状况。3.肾功能:单纯CRF组大鼠在成模后肾功能持续下降,尿量、尿蛋白水平持续增加。Dynepo可减轻尿量、尿蛋白水平的变化。10IU/kg Dynepo可延缓肌酐排泄率的下降,保护肾功能;而100IU/kg Dynepo未能改善CRF大鼠肾功能。4.血压:CRF大鼠血压升高,10IU/kg Dynepo对CRF大鼠血压基本没有影响,而100IU/kg Dynepo可显著加重CRF大鼠高血压。5.钙磷代谢:CRF大鼠尿钙升高、血磷升高、尿磷排泄率下降,10IU/kg Dynepo干预可改善磷的代谢紊乱,而100IU/kg Dynepo干预对CRF大鼠磷代谢紊乱没有显著影响。Dynepo干预对尿钙水平没有显著影响。6.血常规:Dynepo可改善CRF大鼠贫血状况,升高CRF大鼠血红蛋白水平,升高的幅度随Dynepo浓度的增加而增高。而Dynepo对大鼠白细胞、血小板数量没有显著影响。7.血清氧化应激水平:CRF大鼠血清氧化应激水平持续升高,Dynepo可降低CRF大鼠血清氧化应激水平,且降低血清氧化应激水平的能力同Dynepo剂量呈正相关。8.大鼠死亡率:假手术组在实验结束时大鼠死亡率为零;单纯CRF组、CRF+Dynepo100组自术后第三周大鼠开始死亡,CRF+Dynepo10组自术后第5周大鼠开始死亡。此后三组大鼠死亡率不断攀升至观察期末,CRF+Dynepo100组大鼠死亡率(55%)高于单纯CRF组(45%),而CRF+Dynepo10组大鼠死亡率(40%)低于单纯CRF组和CRF+Dynepo100组。结论10IU/kg Dynepo可降低CRF大鼠血清氧化应激水平,降低肾衰竭大鼠尿蛋白、调节磷代谢紊乱、延缓肾衰竭进程、降低CRF大鼠总死亡率。推测其降低大鼠死亡率的机制可能与降低机体内氧化应激水平、保护肾小管上皮细胞、保护残余肾功能有关。而大剂量Dynepo干预在改善CRF大鼠营养状况、降低24尿蛋白定量、降低血清氧化应激水平的同时,加重了CRF大鼠高血压及其它副作用,最终使大鼠死亡率升高。第二部分中国东部地区慢性肾衰竭患者血清铝水平调查及其影响因素分析铝是地壳中含量最丰富的金属元素,在人体内微量存在,大量蓄积可产生毒性作用。国内外许多流行病学调查和研究表明,铝在体内慢性积蓄可致神经元损伤,引起学习和记忆方面能力的下降。大量研究表明,铝所导致的神经系统功能障碍,是一个长期的慢性病理过程,涉及脑发育的各个阶段,许多神经系统疾病,如阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease AD)、透析性痴呆、帕金森病(Parkinson’sDisease,PD)等均与慢性铝蓄积有关。慢性肾功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)患者,除了从呼吸道和食物摄取铝外,还通过其他途径如含铝药物、透析液等接触更多的铝。另外,肾功能逐渐丧失,机体排泄铝的途径受阻,铝元素在肾衰竭患者体内更易蓄积。准确的铝负荷测定是检测、诊断和治疗铝负荷过重的基础,对CRF患者尤为重要。国内医疗水平决定了大部分肾衰竭患者透析不够充分,加上不同地区饮用水质量差异、特殊的饮食习惯,使国内CRF患者处于铝中毒高度危险的状态。然而目前尚缺乏对国内CRF患者血清铝总体水平及其影响因素的第一手临床资料及相关的调查研究。本部分以我国东部辽宁、山东、北京、江苏四个省市10所医院319名长期血液透析患者及281名非透析慢性肾衰竭患者为研究对象,检测其血清铝水平,探讨血清铝水平及其影响因素,为更好的调整CRF患者特别是血液透析患者的血清铝水平提供依据。研究目的检测中国东部地区CRF患者及正常健康者血清铝水平,探讨血清铝水平与各种因素的相关关系,为进一步了解中国东部地区CRF患者血清铝水平,更好的调整CRF患者特别是血液透析患者血清铝水平提供依据。研究方法收集CRF患者及正常健康对照者静脉血血清、每个透析中心透析用水、最终透析液及当地饮用水标本,采用石墨炉原子吸收光谱法测定各样本铝元素含量。对所得数据和资料进行统计学处理,分析年龄、性别、透析与否及透析时间、饮食偏好、磷结合剂、促红细胞生成素及维生素D、输血和血清中其他微量元素对该地区CRF患者血清铝水平的影响。结果1.本次调查的中国东部地区CRF患者血清铝水平为26.64±6.73μg/L,显著高于正常人血清铝平均水平1.77±0.47μg/L(p＜0.001)。其中规律血液透析CRF患者血清铝平均水平为29.21±6.38μg/L,显著高于非透析保守治疗的CRF患者血清铝平均水平23.39±7.68μg/L(p＜0.001)。与欧洲国家CRF-H患者血清铝相比,中国东部CRF-H患者血清铝水平显著高于欧洲国家(p＜0.001),与非洲国家CRF-H患者血清铝水平相近。2.CRF患者血清铝水平与患者年龄及患病时间显著相关,与患者性别无任何相关。3.CRF患者血清铝水平存在地区差异,但是这种差异与各透析中心透析用水及各城市饮用水铝含量没有相关性。4.服用含铝磷结合剂、VitD及接受EPO、输血治疗的CRF患者血清铝水平显著高于未接受此项治疗的患者。5.非透析CRF患者血清铝水平同血肌酐水平呈正相关。CRF患者血清铝水平与血清钙呈显著正相关,与血清锶水平无显著相关。6.饮食偏好与CRF-H患者血清铝水平显著相关,而对CRF-NH患者无任何影响。CRF-H患者血清铝水平与蔬菜水果在食物中所占的百分比呈现显著负相关(r=-0.231,p＜0.05),与肉类食品在饮食中所占的百分比呈现显著正相关(r=0.281,p＜0.01),与谷物及海产品在饮食中的比例无显著相关关系(p＞0.05)。结论中国东部地区慢性肾衰竭患者血清铝负荷较高,显著高于欧美等发达国家,长期透析患者血清铝水平高于非透析患者。CRF患者血清铝水平与患者年龄、饮食习惯、患病时间、肾功能、血清钙水平及治疗措施显著相关。