白血病是严重危害人民健康的常见血液系统恶性肿瘤,高剂量化疗联合造血干/祖细胞移植已成为最终治愈白血病的有效途径。与异体造血干/祖细胞移植相比,自体移植具有植活容易、无移植物抗宿主病、无需配型、不存在供者来源问题等诸多优点,具有重要的临床应用价值。然而,自体移植物中残留的白血病细胞可引起白血病复发。因此,寻找有效而简便的体外净化方法是自体移植成功的关键,国内外学者在此领域开展了大量工作,如物理净化法、化学净化法、免疫净化法、生物净化法等;但是,由于种种缺陷限制了它们的实际应用。体外净化的关键是尽可能地杀灭残存的白血病细胞,同时尽量保存正常的造血干/祖细胞,光动力疗法(PDT)为此提供了可能。PDT治疗肿瘤的基本原理是:光敏剂(PS)接受特定波长光的光能后,通过光化学反应和能量传递过程将光能转化为分子内能,在有氧条件下,产生多种活性氧物质(ROS),使细胞的结构和功能受到严重影响,从而干扰肿瘤细胞的生长并导致其死亡。然而,PS本身对肿瘤细胞并没有作用,只有在接受特定波长光照发生光敏反应后所产生的ROS才具有杀伤效应;而且,PDT杀伤细胞的活性与细胞内的PS含量密切相关。因此PDT具有两重选择性,第一是PS在肿瘤组织的选择性积聚,第二是光照波长和部位选择。国内外有关PDT骨髓净化作用的报道并不多,而且未见有关正常骨髓细胞与白血病细胞内PS含量动态变化差异的报道。研究表明PDT可选择性杀伤白血病细胞,对正常造血干/祖细胞的影响相对甚小。但在研究中所采用的白血病细胞集落形成实验不能敏感地检测微小残留病灶,难以客观地评价骨髓净化效果。有关体内检测骨髓净化效果的报道至今未见。大量的实验<WP=5>研究表明PDT对肿瘤的治疗作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡而产生的。但是,由于各种PS理化性质的差异以及所作用细胞种类的不同,PDT诱导的细胞凋亡途径和方式也不同。目前,PDT主要应用于实体瘤的治疗研究;有关PDT对白血病细胞的体内杀伤作用,国内外均未见报道。由于激光在组织中有限的穿透深度限制了PDT的抗肿瘤效应,人们试图通过调动机体的免疫机制来清除PDT后残存的肿瘤细胞,研究表明联合免疫治疗可显著增强PDT对小鼠鳞状细胞癌(SSCVⅡ)的抑瘤效应。有关联合PDT与B7.1、GM-CSF基因修饰瘤苗治疗小鼠淋巴瘤,国内外均未见报道。本研究应用我国自己合成的一种两亲性酞菁配合物——二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌(ZnPcS2P2)作为PS,首先研究正常骨髓单个核细胞(MNC)、K562细胞、高致瘤性HL60细胞(简称hHL60细胞)与ZnPcS2P2共孵育后细胞内ZnPcS2P2含量的动态变化,选择孵育后的最佳光照时间点,以优化实验条件;研究ZnPcS2P2介导的PDT(ZnPc-PDT)对正常造血细胞、K562细胞、hHL60细胞的杀伤作用。然后,我们在正常骨髓细胞中按照缓解标准掺入一定量的K562细胞制备模拟缓解骨髓模型,研究ZnPc-PDT对其中K562细胞的净化作用,用灵敏度高、特异性强的巢式RT-PCR方法检测体外净化效果。进而,我们在BALB/C小鼠正常骨髓细胞中掺入不同数量的小鼠红白血病EL9611细胞制备混合物,在体研究ZnPc-PDT的净化效果。另外,我们还研究ZnPc-PDT对K562细胞、hHL60细胞的杀伤机制。为了研究ZnPc-PDT的体内抗白血病细胞效应,应用hHL60细胞裸鼠移植瘤模型,研究尾静脉注射ZnPcS2P2后荷瘤裸鼠体内各组织器官ZnPcS2P2含量的动态变化及ZnPc-PDT对hHL60细胞的体内杀伤作用。鉴于激光在组织中有限的穿透深度可能影响ZnPc-PDT的抗肿瘤效果,且免疫瘤苗可显著增强PDT的抗肿瘤作用,因而研究了ZnPc-PDT联合mB7.1与mGM-CSF免疫基因修饰的瘤苗治疗小鼠淋巴瘤模型的作用,以期使ZnPc-PDT发挥最大抗肿瘤效应,为ZnPc-PDT应用于血液肿瘤的治疗提供有力的实验依据、开拓新的思路。本文的主要研究包括以下三个方面:一、ZnPc-PDT对正常骨髓造血细胞、K562细胞、hHL60细胞、EL9611细胞的作用1、正常骨髓MNC、K562细胞、hHL60细胞内ZnPcS2P2含量测定:上述细胞与终浓度为1.0μg/ml的ZnPcS2P2共孵育。12h内每1h收集一组细胞,第24h再收集<WP=6>一组细胞。洗涤、计数,超声破碎细胞,制备细胞裂解产物上清,应用荧光分光光度法检测细胞内的ZnPcS2P2含量,据此了解正常骨髓MNC、白血病细胞系内ZnPcS2P2含量的变化是否存在差异。2、ZnPc-PDT对正常骨髓MNC、K562细胞、hHL60细胞增殖的影响:根据上述实验结果发现在与ZnPcS2P2孵育5h时,K562细胞、hHL60细胞内ZnPcS2P2含量分别处于较高及最高水平,而正常MNC细胞则处于最低水平;使白血病细胞与正常MNC细胞内的ZnPcS2P2含量比值达到最高值。因此,实验设计方案为: 5×106/ml的细胞,分别加入终浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0μg/ml的ZnPcS2P2,孵育5h后光照;同时设立生理盐水对照组(加入相同体积的生理盐水)、光对照组(不加ZnPcS2P2,加入相同体积的生理盐水孵育5h后光照)、含1.0μg/ml ZnPcS2P2的PS对照组(仅与ZnPcS2P2孵育5h,不光照)。光照条件:用670nm激光以53mW/cm2的功率密度、2.1J/cm2的能量密度照射。正常混合集落形成细胞(CFU-Mix)、粒-单核系造血祖细胞(CFU-GM)、红系造血祖细胞(CFU-E)等集落形成实验检测ZnPc-PDT对正常造血干/祖细胞的影响。MTT比色法、台盼兰拒染法、白血