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第一部分卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘退变模型的研究目的：对卵巢切除大鼠进行脊柱融合手术,观察脊柱融合术后相邻节段椎间盘退变情况,探讨脊柱融合术后相邻节段椎间盘的退变情况和病理特点以及骨质疏松对相邻节段椎间盘退变的影响。方法：40只雌性3月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠分为以下4组:Sham组(假手术组),OVX组(卵巢切除组),PLF组(脊柱融合手术组)以及OVX+PLF组(卵巢切除+脊柱融合手术)。在大鼠3月龄时进行OVX手术,4周后再行脊柱融合手术。对L4-5节段进行双侧脊柱融合手术并取自体髂骨研磨进行骨移植以及棘突钢丝环形缠绕。脊柱融合后12周,先进行X-ray扫描观察融合情况并进行影像学评分,再处死动物取出L3-6节段及其椎间盘。采用手法评估判断融合情况,分离L5-6椎间盘及相邻椎体,进行脱钙、包埋、切片以及染色。对L5-6椎间盘进行van Gieson染色观察相邻节段椎间盘退变情况并进行组织学评分。结果：1融合情况评估影像学检测结果:与对照组相比,X-ray检测显示OVX和OVX+PLF组大鼠脊柱的影像学密度以及椎间盘高度降低。与PLF组相比,OVX+PLF组大鼠融合部位面积较小。PLF组的影像学评分为3.00±0.92,OVX+PLF组的影像学评分则为2.15±0.88。OVX+PLF组明显低于PLF组(P<0.05)。Sham与OVX组无手术故无融合。手法检测结果:对进行PLF手术的大鼠(PLF和OVX+PLF组)进行手法检查,发现棘突缠绕的钢丝完整且固定良好。所有进行PLF的大鼠均未检测到融合节段的活动。2椎间盘退变情况PLF和OVX+PLF组大鼠可见终板钙化增加,髓核细胞减少并且部分已向软骨细胞方向化生,并有粘液样变性,纤维环排列紊乱。且OVX+PLF组的椎间盘退变程度高于PLF组。组织学评分显示,Sham组为1.21±0.45,OVX组为3.20±0.45,PLF组为3.01±0.71,OVX+PLF组5.41±1.14。PLF组明显高于Sham组(P<0.05),且OVX+PLF组明显高于PLF组(P<0.05)。结论：采用脊柱融合手术以及棘突钢丝固定可使邻近节段椎间盘发生退变,且在骨质疏松的情况下邻近节段椎间盘退变更加严重。在临床和大型动物实验中,相邻节段椎间盘退变的发展时间较长,从而限制了其研究,而本实验采用大鼠模型进行试验,不仅经济可靠,且可以快速造模、缩短实验周期,对阐述相邻节段椎间盘退变的病理过程以及使用药物干预治疗提供了良好的模型。第二部分阿仑膦酸钠对卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘退变的潜在保护作用探讨阿仑膦酸钠(Alendronate,ALN)对卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘退变的作用。方法：50只雌性3月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠分为以下5组:Sham+V组(假手术组),OVX+V组(卵巢切除组),PLF+V组(脊柱融合手术组),OVX+PLF+V组(卵巢切除+脊柱融合手术)以及OVX+PLF+ALN组(卵巢切除+脊柱融合手术+皮下注射ALN)。Sham组仅切开皮肤暴露卵巢但不切除。在大鼠3月龄时进行OVX手术,4周后再行脊柱融合手术。对双侧L4-5节段进行双侧脊柱融合手术并取自体髂骨研磨进行骨移植以及棘突钢丝环形缠绕。OVX+PLF+ALN组脊柱融合后即开始皮下注射ALN,剂量为70μg/Kg·W,每周一次。Sham、OVX、PLF及OVX+PLF组大鼠给予等体积的生理盐水作为对照。脊柱融合后12周,处死动物并取出L3-6节段及其椎间盘,同时采血2m L,置于-80℃保存用于骨代谢标记物检测。先采用手法评估判断融合情况,再磨钻分离双侧L4-5横突间融合部位并分离L5-6椎间盘及相邻椎体,进行脱2椎间盘退变情况钙、包埋、切片以及染色。对融合部位采用HE染色观察新成骨情况并进行组织学评分。对L5-6椎间盘进行van Gieson染色观察相邻节段椎间盘退变情况并进行组织学评分。同时,基于VG染色图像测量对椎间盘高度、终板厚度及终板钙化面积比等进行测量,且均。结果1融合情况评估组织学检测结果:PLF+V和OVX+PLF+V组大鼠L4-5横突间为不规则编制骨,有骨样基质形成,其间有软骨样及成纤维样组织形成,尚有小部分死骨存在。而OVX+PLF+V组大鼠融合部位骨形成程度不及PLF+V组。OVX+PLF+ALN组大鼠融合部位表现出相互交联的骨小梁以及之间的骨髓。PLF+V组的组织学评分为3.60±1.00,OVX+PLF+V组的组织学评分为3.21±1.21,OVX+PLF+ALN组的组织学评分为5.34±1.40。OVX+PLF+ALN组的组织学评分明显高于OVX+PLF+V组(P<0.05)。Sham与OVX组无手术故无融合。手法检测结果:对进行PLF+V手术的大鼠(PLF+V、OVX+PLF+V和OVX+PLF+ALN组)检查发现棘突缠绕的钢丝完整且固定良好。所有进行PLF的大鼠均未检测到融合节段的活动。2椎间盘退变情况PLF+V和OVX+PLF+V组大鼠可见终板钙化增加,髓核细胞减少并且部分已向软骨细胞方向化生,并有粘液样变性,纤维环排列紊乱。且OVX+PLF+V组的椎间盘退变程度要高于PLF+V组。OVX+PLF+ALN组的髓核内仅有少量软骨样细胞,未见有粘液性变性,其退变程度较轻。组织学评分显示,Sham+V组为1.21±0.45,OVX+V组为3.20±0.45,PLF+V组为3.01±0.71,OVX+PLF+V组5.41±1.14。PLF+V组明显高于Sham+V组(P<0.05),且OVX+PLF+V组明显高于PLF+V组(P<0.05)。且OVX+PLF+ALN组要明显低于OVX+PLF+V组(P<0.05)。3参数测量结果OVX+V组、PLF+V组和OVX+PLF+V组椎间盘高度明显低于Sham+V组(P<0.05),而终板厚度和终板钙化面积比率明显高于Sham+V组(P<0.05)。然而,经ALN干预12周后,OVX+PLF+ALN组大鼠椎间盘高度显著高于OVX+PLF+V组(P<0.05),而终板厚度和终板钙化面积比率显著低于OVX+PLF+V组(P<0.05)。4血清骨代谢标记物ELISA分析与Sham+V组相比,OVX+V组、PLF+V组和OVX+PLF+V组的血清OC水平明显下降(P<0.05),CTX-I明显升高(P<0.05)。而O VX+PLF+ALN组血清OC水平明显高于OVX+PLF+V组(P<0.05),CTX-I明显低于OVX+PLF+V组(P<0.05)。结论：在卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘退变模型中,早期皮下注射ALN能够延缓相邻节段椎间盘退变。ALN是一种缓解椎间盘退变的潜在性药物,本实验为临床应用提供了良好的实验基础,但其机制有待进一步研究。第三部分阿仑膦酸钠延缓大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘退变的作用目的：ALN可以延缓邻近节段椎间盘退变,但其调节机制尚未得到阐述。本实验应用卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘退变模型,早期皮下注射ALN进行干预,观察ALN对卵巢切除大鼠脊柱融合后相邻节段椎间盘退变的影响,并初步分析其作用机制。方法：50只雌性3月龄Sprague-Dawley(SD)大鼠分为以下5组:Sham+V组(假手术组),OVX+V组(卵巢切除组),PLF+V组(脊柱融合手术组),OVX+PLF+V组(卵巢切除+脊柱融合手术)以及OVX+PLF+ALN组(卵巢切除+脊柱融合手术+皮下注射ALN)。Sham组仅切开皮肤暴露卵巢但不切除。在大鼠3月龄时进行OVX手术,4周后再行脊柱融合手术。对双侧L4-5节段进行双侧脊柱融合手术并取自体髂骨研磨进行骨移植以及棘突钢丝环形缠绕。OVX+PLF+ALN组脊柱融合后开始皮下注射ALN,剂量为70μg/Kg·W,每周一次。Sham+V、OVX+V、PLF+V及OVX+PLF+V组大鼠给予等体积的生理盐水作为对照。脊柱融合后12周,进行X-ray扫描观察融合情况并进行影像学评分,之后处死动物并取出L3-6节段及其椎间盘。采用手法评估判断融合情况,之后使用磨钻分离双侧L4-5横突间融合部位以及L5-6椎间盘及相邻椎体,进行脱钙、包埋、切片以及染色。对融合部位采用HE染色观察新成骨情况并进行组织学评分。L6椎体的BMD及微结构分别采用双能X线及Micro-CT测量对L5-6椎间盘进行van Gieson染色观察相邻节段椎间盘退变情况并对染色结果进行组织学评分。同时,对微血管密度以及微血管面积比等进行测量,且均基于VG染色图像。免疫组织化学染色及real-time PCR用于检测各组大鼠椎间盘中aggrecan、I型胶原、II型胶原、MMP-13及ADAMTS-4表达的变化。3D运动试验用于相邻节段L5-6椎间盘的6自由度的检测。结果：1融合情况评估手法检测结果:对进行PLF手术的大鼠(PLF+V,OVX+PLF+V和OVX+PLF+ALN组)检查发现棘突缠绕的钢丝完整且固定良好。所有进行PLF的大鼠未检测到融合节段的活动。2 L6椎体的BMD以及Micro-CT结果OVX+V组和OVX+PLF+V组大鼠L6椎体的BMD均明显低于Sham+V组(P<0.05)。OVX+PLF+ALN组大鼠L6椎体的BMD明显高于OVX+PLF+V组(P<0.05)。OVX+V组和OVX+PLF+V组大鼠L6椎体的BV/TV、Tb.N及Tb.Th均显著低于Sham+V组(P<0.05),而Tb.Sp及SMI则显著高于Sham+V组(P<0.05)。OVX+PLF+ALN组椎体BV/TV、Tb.N及Tb.Th显著高于OVX+PLF+V组(P<0.05),Tb.Sp及SMI则显著低于OVX+V组(P<0.05)。3椎间盘退变的组织学分析及评分OVX+V、PLF+V和OVX+PLF+V组大鼠可见终板钙化增加,髓核细胞减少并且部分已向软骨细胞方向化生,并有粘液样变性,纤维环排列紊乱。且OVX+PLF+V组的椎间盘退变程度高于PLF组(P<0.05)。OVX+PLF+ALN组的髓核内仅有少量软骨样细胞,未见有粘液性变,其退变较轻。组织学评分显示,Sham+V组为1.21±0.45,OVX+V组为3.20±0.45,PLF+V组为3.01±0.71,OVX+PLF+V组5.41±1.14。PLF+V组明显高于Sham+V组(P<0.05),且OVX+PLF+V组明显高于PLF+V组(P<0.05)。而OVX+PLF+ALN组要明显低于OVX+PLF+V组(P<0.05)。4参数测量结果OVX+V组、PLF+V组和OVX+PLF+V组微血管数量以及微血管面积明显低于Sham+V组(P<0.05)。然而,经ALN干预12周后,OVX+PLF+ALN组大鼠微血管数量以及微血管面积显著高于OVX+PLF+V组(P<0.05)。5椎间盘退变的免疫组织化学染色结果及IOD值分析在髓核内,OVX+V组、PLF+V组和OVX+PLF+V组部分髓核被软骨样细胞代替,其MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I表达增高,Col-II、Aggrecan表达则降低。MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I的IOD值明显高于Sham+V组(P<0.05),而Col-II、Aggrecan明显低于Sham+V组(P<0.05)。而OVX+PLF+ALN组MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I显著低于OVX+PLF+V组(P<0.05),Col-II、Aggrecan表达则显著高于OVX+PLF+V组(P<0.05),MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I的IOD值明显低于OVX+PLF+V组(P<0.05),而Col-II、Aggrecan明显高于OVX+PLF+V组(P<0.05)。在纤维环内,OVX+V组、PLF+V组和OVX+PLF+V组纤维环排列较紊乱,其MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I表达增高,Col-II、Aggrecan表达则降低。MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I的IOD值明显高于Sham+V组(P<0.05),而Col-II、Aggrecan明显低于Sham+V组(P<0.05)。而OVX+PLF+ALN组MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I显著低于OVX+PLF+V组(P<0.05),Col-II、Aggrecan表达则显著高于OVX+PLF+V组(P<0.05),MMP-13、ADAMTS-4以及Col-I的IOD值明显低于OVX+PLF+V组(P<0.05),而Col-II、Aggrecan明显高于OVX+PLF+V组(P<0.05)。6 Real-time PCR结果分析对L3-4椎间盘进行RT-PCR检测显示,OVX+V组、PLF+V组和OVX+PLF+V组Col2α1和Aggrecan明显低于Sham+V组(P<0.05),而Col1α1、MMP-13以及ADAMTS-4明显高于Sham+V组(P<0.05)。给予ALN干预12周后,OVX+PLF+ALN组Col2α1和Aggrecan明显高于OVX+PLF+V组(P<0.05),而Col1α1、MMP-13以及ADAMTS-4明显低于OVX+PLF+V组(P<0.05)。7 3D运动试验结果在前屈、左右旋转以及左右侧弯的加载中,PLF+V组、OVX+PLF+V组以及OVX+PLF+ALN组L5-6节段之间运动范围均较Sham+V组减少(P<0.05)。三组之间无差别。结论：1骨质疏松加重相邻节段椎间盘退变,提示骨质疏松是脊柱融合术后相邻节段椎间盘退变的危险因素。2早期给予ALN干预可有效缓解卵巢切除大鼠相邻节段椎间盘退变的进程。其可能与维持椎体骨密度以及微结构完整性和稳定性,并可以增加终板血管数量及面积,保护椎间盘营养通路。同时,ALN可以调节椎间盘基质的代谢平衡,帮助维持椎间盘的完整和功能。3 ALN可以认为是一种能够缓解骨质疏松状态下脊柱融合后相邻节段椎间盘退变的潜在性药物。