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黄曲霉毒素B1(AFB1)是由黄曲霉等真菌产生的一种强致癌性真菌毒素,ROS介导的氧化应激是其合成的先决条件,抗氧化剂能有效抑制毒素合成。前期研究发现茶多酚能显著降低黄曲霉胞内氧化压力,抑制AFB1的生物合成,但作用机理尚不明确。因此,本文首先考察了五种茶多酚单体:儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对AFB1合成的抑制效果,明确了起主要抑制作用的单体,并探究了单体空间结构与抑制产毒能力之间的关系;然后通过RNA-Seq技术研究了该单体对黄曲霉基因转录水平的影响,从中挖掘出AFB1合成途径、氧化应激信号传导途径中响应该单体作用的关键基因;最后从基因转录、蛋白表达及修饰、AFB1合成代谢途径等方面分析茶多酚单体对AFB1合成的抑制作用,阐明茶多酚抑制AFB1合成的分子机制,主要结果如下:1.五种茶多酚主要单体对黄曲霉生长无明显抑制作用,未对菌丝体结构造成破坏,但可有效抑制AFB1的合成,抑制率最高可达92.00%(2 mg/mL EGCG),抑制作用由大到小为:EGCG>EC>ECG>EGC>C,表明EGCG是抑制AFB1合成的主要单体。为进一步研究单体空间结构与抑制AFB1合成的关系,采用Gaussian 09软件中DFT计算方法在B3LYP/6-31G(d,p)基组下计算了五种茶多酚单体的键长键角、酚羟基氢带电荷数、前线轨道能量等参数。发现茶多酚单体化合物C9位羟基成酯后抑制AFB1合成能力增强;化合物酚羟基数越多,酚羟基氢带正电荷数越大,则茶多酚单体的抗氧化活性越高,且单体抑制AFB1合成的能力越强,说明茶多酚单体清除自由基的能力影响其抑制AFB1合成的效果;分子的LUMO轨道能级越小,抑制AFB1合成能力越强,说明茶多酚单体抑制AFB1时以清除电子为主。2.对黄曲霉转录组数据进行分析,发现EGCG使黄曲霉927个基因发生了显著性差异表达(p<0.05),其中496个基因下调,431个基因上调,上调基因主要参与抗氧化酶及脂质的合成,下调基因主要涉及细胞受氧化压力等刺激所激活的信号传导途径。经EGCG处理后,AFB1合成所需前期基因(aflA、aflC、aflE)、中期基因aflJ及毒素合成的特异性调控因子基因aflR均发生了下调;且氧化应激介导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径中MAP激酶激酶Mkk2、MAP激酶SakA及其下游转录因子AtfA的基因转录水平也发生了下调。推测EGCG通过MAPK途径抑制AFB1合成基因簇中aflA、aflC、aflE、aflJ、aflR的表达,减少AFB1的合成。3.基于黄曲霉转录组的数据分析,进一步研究了EGCG对黄曲霉胞内ROS水平、细胞质与细胞核中激酶SakA蛋白表达及磷酸化水平、转录因子基因atfA及AFB1合成基因簇中afl A、aflC、aflE、aflJ、aflR的转录水平、AFB1及其前体物质NOR合成的影响。结果显示:EGCG能显著降低黄曲霉胞内ROS水平,缓解菌体胞内氧化压力;抑制ROS对SakA的激活,使细胞质与细胞核中该激酶磷酸化水平分别下降了38.92%和78.64%;下调atfA、aflA、aflC、aflE、afl J、aflR的转录水平,使AFB1前体物质NOR的合成量减少70.91%,进而阻断了AFB1的合成(抑制率为87.50%)。上述结果表明EGCG通过降低胞内ROS含量,抑制了ROS介导的SakA/AtfA信号通路对毒素合成基因簇上基因(aflA、aflC、aflE、aflJ、aflR)的转录激活,限制毒素合成前体物质的供应,阻断了AFB1的合成。本课题的研究进一步丰富了人们对黄曲霉毒素B1合成的复杂调控网络的认识,为筛选和开发适用于控制食品中黄曲霉毒素B1污染的天然抑制剂奠定了理论基础。