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目的软骨组织损伤是近年来常见的疾病,创伤及非创伤性的病理损伤为其常见病因,由于软骨结构由Ⅱ型胶原相互交织形成三维网状结构及包埋其中的蛋白多糖及软骨细胞所构成,而且软骨组织内没有血管及软骨细胞的增生及迁移能力有限,因此软骨损伤后的软骨自身修复能力差。目前临床上没有较好的方法来治疗软骨缺损,近年来利用组织工程学方法治疗软骨缺损成为研究的热点之一。而组织工程学所应用的种子细胞主要包括成体干细胞及自体软骨细胞。自体软骨细胞由于存在细胞数目少、移植后远期效果不佳以及供区可发生并发症等问题,而影响了其在临床的应用。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell s, bMSCs)是骨髓中除了造血干细胞之外的另一类成体干细胞,具有多向分化潜能,在不同的条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞及神经细胞,但目前由于没有特异性的表型,其鉴定尚无统一标准,大多数鉴定依赖于其形态水平、功能特征及培养过程中出现的分化表型来协助鉴定骨髓间充质干细胞。由此成功分离培养骨髓间充质干细胞,并诱导分化为成软骨细胞,对治疗软骨损伤具有重要意义。本实验采用体外培养扩增、鉴定兔骨髓间充质干细胞,利用其分化潜能,观察其诱导分化为成软骨细胞的可行性。方法1. BMSCs的分离纯化与培养：取3月龄健康新西兰大耳白兔6只,行双侧胫骨结节平台穿刺抽取骨髓5 mL,以1.073g/ml密度Percoll分离液结合密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell s, bMSCs),悬浮于含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基(含青霉素100U/mL,链霉素100 U/mL),轻轻吹打均匀,接种到25 cm2培养瓶,置37℃,体积分数为5% CO2及饱和湿度培养箱中培养,按1：2比例传代培养。2. BMSCs生长曲线的测定：取第3代生长良好的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液,以每孔细胞浓度为1×108L-1分别接种于24孔板中的各孔,每孔1 mL,置于37℃、体积分数为5% CO2及饱和湿度培养箱中孵育。于第2天起每日取3孔,去除培养液,胰酶消化后制备成细胞悬液,以细胞计数板进行细胞计数,计算平均值,以细胞数为纵坐标,时间为横坐标绘制细胞生长曲线。3. BMSCs的细胞表面标志鉴定：细胞生长接近融合时,取第5代生长良好的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用PBS缓冲液冲洗2遍,并制备成(5~10)×108L-1浓度的细胞悬液,取0.1 mL细胞悬液置于不同离心管中,各个离心管中分别加入CD29、CD44、CD45的一抗,37℃孵箱孵育20 min后,以PBS缓冲液冲洗2遍后,加入二抗37℃孵箱孵育20 min,冲洗后重悬细胞于0.5 mL PBS缓冲液中为流式细胞分析用。4. BMSCs向成软骨细胞的诱导：取第3代生长良好的兔BMSCs,以1×108L-1的细胞浓度接种于内含盖玻片的12孔培养板内,培养24 h后,待细胞完全贴壁,将细胞设为对照组和诱导组,对照组继续以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM常规培养液培养,诱导组换成含成软骨诱导剂的H-DMEM培养液(含TGF-1 10μg/L、IGF-Ⅰ110μg/L、转铁蛋白6.25 mg/L、地塞米松10 mmol/L、维生素C 0.05mmol/L),每2 d或3 d换液1次,倒置显微镜下观察细胞形态变化。诱导21 d后免疫细胞化学染色,观察细胞Ⅱ型胶原表达情况。结果1.细胞形态学观察原代细胞2 d或3 d首次换液后,可见少量单个核细胞贴壁生长,多为短柱性或多角形。4 d或5 d全量换液,去除大量漂浮的细胞,可见分散的BMSCs小集落,细胞逐渐转变为长梭形,胞核为圆形或椭圆形,胞浆内可见较多的颗粒。6～9 d时细胞迅速生长,小集落逐渐融合成大集落,可呈辐射状生长,10～14 d细胞大部分融合,达90%以上,细胞形态均匀,长梭形,排列紧密,呈旋涡状或菊花状。传代培养后,细胞形态更为均一,排列更加整齐,增殖速度明显加快,6～8 d细胞可融合达90%以上,可再行传代。2. BMSCs生长曲线细胞生长2 d内处于潜伏期,生长缓慢,3～5 d进入对数增长期,呈对数增长,6～8 d处于平台期,细胞铺满瓶底,增殖缓慢。3.流式细胞结果分析3.1原代细胞流式细胞分析结果：原代细胞有62.4%的细胞表达CD29,有60.3%的细胞表达CD44,有2.79%的细胞表达CD45。3.2传代细胞的流式细胞分析：第3代有99.9%的细胞表达CD29,有99.6%的细胞表达CD44,有2.62%的细胞表达CD45。4.Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色BMSCs诱导21 d后可见Ⅱ型胶原阳性细胞较多,阳性位置位于胞浆内,呈棕黄色至棕褐色细密颗粒,在胞核周围更加明显。平行培养未诱导的BMSCs棕黄色颗粒不明显,着色较浅,阳性细胞数目较少。结论1.本实验首次通过流式细胞术显示原代细胞与第3代细胞各因子表达情况不同,原因可能是原代细胞通过密度梯度离心法分离后,仍有部分其他细胞伴随培养,随着细胞的扩增传代,杂细胞逐渐减少,BMSCs的纯度越来越高,第3代细胞高度表达CD29、CD44而不表达CD45,表明所培养的BMSCs是单一的细胞群,不含造血细胞等其他细胞,其纯度较高。2.本实验研究发现骨髓间充质干细胞在含TGF-β1和IGF-Ⅰ的诱导培养液中诱导后体外扩增能力明显降低,诱导21 d后形态变化比较显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色明显。3.本实验应用密度梯度离心法可成功分离并扩增骨髓间充质干细胞,第3代细胞纯度较高,在适当的条件下,具有分化为成软骨细胞的潜能。