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第一部分 CSE腹腔注射肺气肿小鼠肺内CD31-CD45-Sca-1+细胞数量和Shh信号通路的变化 目的:检测腹腔注射香烟烟雾提取物(CSE)所致肺气肿小鼠的肺组织内CD31-CD45-Sca-1+细胞数量和Shh信号通路的表达水平。 方法:将40只BALB/c近交系雄性小鼠，按随机数字表法随机分为PBS组和CSE组，每组各20只。在第1、11、22天，PBS组腹腔注射PBS缓冲液(0.01M，PH7.2-7.4)，CSE组腹腔注射CSE(0.3ml)。在第28天结束建模，处死小鼠。小动物肺功能仪测定肺功能，记录气道阻力（Raw）和动态肺顺应性(Cdyn)等。肺组织病理切片苏木素-伊红（HE）染色后测定平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)。采用酶消化法制备全肺组织单细胞悬液后，流式细胞术检测肺CD31-CD45-Sca-1+细胞占全肺细胞百分比。实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测小鼠肺组织Shh信号通路的三个关键组分Shh、Ptch1和Gli1的mRNA和蛋白表达水平。免疫组织化学法检测Shh、Ptch1和Gli1在小鼠肺组织的分布及表达。采用SPSS18.0统计软件包进行数据分析，正态分布的各组计量资料以((x)±s)表示，采用两独立样本t检验比较两组间均数，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果:(1)CSE组小鼠气道阻力(Raw)较PBS组增高[（0.48±0.28）cmH2O· mL-1· min-1 vs.(0.24±0.14) cmH2O· mL-1·min-1，P＜0.05], CSE组小鼠动态肺顺应性(Cdyn)较PBS组降低[(0.054±0.019) ml/cmH2O vs.(0.074±0.030) ml/cmH2O, P＜0.05]。 (2)小鼠肺组织病理学定量分析:CSE组的平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)较PBS组均增高[(42.0±4.2)μm vs.(23.8±0.8)μm，38.2％±2.1％ vs.10.7％±1.3％，均P＜0.05]。 (3)流式细胞术检测小鼠肺CD31-CD45-Sca-1+细胞占全肺细胞百分比:CSE组较PBS组降低(0.87％±0.16％ vs.1.26％±0.18％，P＜0.05)。 (4)实时荧光定量PCR检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的mRNA水平:CSE组Shh、Ptch1和Gli1的mRNA相对表达量较PBS组有降低趋势，但差异均无统计学意义(0.11±0.02 vs.0.38±0.15，0.85±0.28 vs.1.06±0.34,1.01±0.16 vs.1.21±0.14，均P＞0.05)。 (5)免疫印迹法检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的蛋白水平:CSE组的Shh、Ptch1和Gli1的蛋白相对表达量较PBS组均显著降低(0.28±0.15 vs.0.52±0.02,0.12±0.05 vs.0.36±0.05,0.17±0.04 vs.0.45±0.11，均P＜0.05)。 (6)免疫组织化学法检测Shh、Ptch1和Gli1在小鼠肺组织的分布及表达:a.分布:Shh、Ptch1和Gli1在小鼠肺组织中主要表达于肺泡以上气道的上皮细胞，少量表达于肺泡上皮细胞， Shh和Ptch1亚细胞定位在细胞浆和细胞膜，Gli1在细胞浆和细胞核。Shh和Ptch1在PBS组和CSE组中呈弱着色或不着色。b.表达:CSE组Gli1的光密度较PBS组显著降低（6455±2606 vs.13866±6364，P＜0.05），CSE组Shh和Ptch1的光密度较PBS有降低趋势，但差异无统计学意义(8426±3646 vs.9730±3959，4129±2320 vs.6442±3496，均P＞0.05)。 结论:(1)腹腔注射CSE成功建立肺气肿小鼠模型; (2)在腹腔注射CSE所致肺气肿小鼠中肺CD31-CD45-Sca-1+细胞水平下降; (3)在腹腔注射CSE所致肺气肿小鼠肺组织中Shh信号通路受到抑制。 第二部分腺病毒急性感染对肺气肿小鼠肺内CD31-CD45-Sca-1+细胞数量和Shh信号通路的影响 目的:检测腺病毒急性感染对香烟烟雾提取物(CSE)腹腔注射肺气肿小鼠肺组织内CD31-CD45-Sca-1+细胞数量和Shh信号通路表达水平的影响 方法:将60只BALB/c近交系雄性小鼠，按随机数字表法随机分为PBS组、CSE组和CSE+Adenovirus（腺病毒）组，每组各20只。在第1、11、22天，PBS组腹腔注射PBS缓冲液(0.01M，PH7.2-7.4)，CSE组和CSE+Adenovirus组腹腔注射CSE(0.3ml)，第15天，PBS组和CSE组气管内滴注PBS缓冲液(0.01M，PH7.2-7.4)，CSE+Adenovirus组气管内滴注腺病毒(0.3ml，1010ifu/ml)。第28天结束建模，处死小鼠。小动物肺功能仪测定肺功能，记录气道阻力(Raw)和动态肺顺应性(Cdyn)等。肺组织病理切片苏木素-伊红（HE）染色后测定平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)，并对气道和血管炎症进行半定量评分。采用酶消化法制备全肺组织单细胞悬液后，流式细胞术检测肺CD31-CD45-Sca-1+细胞占全肺细胞百分比。实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的mRNA和蛋白表达水平。免疫组织化学法检测Shh、Ptch1和Gli1在小鼠肺组织的分布及表达。采用SPSS18.0统计软件包进行数据分析，正态分布的各组计量资料以((x)±s)表示，三组间两两比较采用单因素方差分析（LSD-t法），P＜0.05为差异有统计学意义。 结果:(1) CSE组的Raw较PBS组增高[(0.48±0.28) cmH2O·mL-1· min-1 vs.(0.24±0.14) cmH2O· mL-1· min-1,P＜0.05],CSE+Adenovirus组Raw也较PBS组增高[(0.49±0.24) cmH2O·mL-1·min-1 vs.(0.24±0.14) cmH2O· mL-1· min-1,P＜0.05],CSE组的Cdyn较PBS组降低[(0.054±0.019)ml/ cmH2O vs.(0.074±0.030)ml/cmH2O,P＜0.05]，CSE+Adenovirus组的Cdyn也较PBS组降低[(0.052±0.014)ml/cmH2O vs.(0.074±0.030) ml/cmH2O,P＜0.05]，但CSE+Adenovirus组的Raw和Cdyn与CSE组之间的差异无统计学意义[（0.49±0.24）cmH2O· mL-1· min-1 vs.(0.48±0.28) cmH2O· mL-1· min-1,(0.052±0.014)ml/cmH2O vs.(0.054±0.019) ml/cmH2O，均P＞0.05]。 (2)小鼠肺组织病理学定量分析:CSE组的平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)较PBS组均增高[(42.0±4.2)μm vs.(23.8±0.8)μm，38.2％±2.1％ vs.10.7％±1.3％,均P＜0.05]; CSE+Adenovirus组的MLI和DI较PBS组均增高[(38.1±2.1)μm vs.(23.8±0.8)μm，39.1％±2.6％ vs.10.7％±1.3％，均P＜0.05]。但CSE+Adenovirus组的MLI和DI与CSE组之间的差异无统计学意义[(38.1±2.1)μm vs.(42.0±4.2)μm，39.1％±2.6％ vs.38.2％±2.1％，均P＞0.05]。 (3)小鼠肺组织气道和血管炎症半定量分析:CSE组的气道炎症半定量评分与PBS组间无显著性差异（0.18±0.08 vs.0.12±0.15，P＞0.05），CSE+Adenovirus组气道炎症半定量评分较CSE组增高（1.81±0.30 vs.0.18±0.08，P＜0.05）。CSE组的血管炎症半定量评分与PBS组间无显著性差异（0.08±0.02 vs.0.01±0.02，P＞0.05），CSE+Adenovirus组血管炎症半定量评分较CSE组增高（2.28±0.38 vs.0.08±0.02，P＜0.05）。 (4)流式细胞术检测小鼠肺CD31-CD45-Sca-1+细胞占全肺细胞百分比:CSE组肺CD31-CD45-Sca-1+细胞比例较PBS组降低(0.87％±0.16％ vs.1.26％±0.18％,P＜0.05),CSE+Adenovirus组肺CD31-CD45-Sca-1+细胞比例较CSE组显著升高（1.30％±0.34％ vs.0.87％±0.16％,P＜0.05）。 (5)实时荧光定量PCR检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的mRNA水平:CSE组Shh、Ptch1和Gli1的mRNA相对表达量较PBS组有降低趋势，但差异均无统计学意义(0.11±0.02 vs.0.38±0.15，0.85±0.28 vs.1.06±0.34,1.01±0.16 vs.1.21±0.14，均P＞0.05),CSE+Adenovirus组Shh和Gli1的mRNA相对表达量较CSE组均增高（1.10±0.48 vs.0.11±0.02,1.40±0.34 vs.1.01±0.36，均P＜0.05），CSE+Adenovirus组Ptch1的mRNA相对表达量较CSE组有升高趋势，但差异无统计学意义(0.98±0.40 vs.0.85±0.28，P＞0.05)。 (6)免疫印迹法检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的蛋白水平:CSE组的Shh、Ptch1和Gli1的蛋白相对表达量较PBS组均降低(0.28±0.15 vs.0.52±0.02,0.12±0.05 vs.0.36±0.05,0.17±0.04 vs.0.45±0.11，均P＜0.05)，CSE+Adenovirus组Shh、Ptch1和Gli1的蛋白相对表达量较CSE组均增高(0.73±0.16 vs.0.28±0.15，0.62±0.08 vs.0.12±0.05,0.56±0.22 vs.0.17±0.04，均P＜0.05)。 (7)免疫组织化学法检测Shh、Ptch1和Gli1在小鼠肺组织的表达:CSE组Gli1的光密度较PBS组显著降低（6455±2606 vs.13866±6364，P＜0.05），CSE组Shh和Ptch1的光密度较PBS有降低趋势，但差异无统计学意义（8426±3646 vs.9730±3959，4129±2320 vs.6442±3496，均P＞0.05），CSE+Adenovirus组Shh、Ptch1和Gli1的光密度较CSE组均升高（17490±7989 vs.8426±3646，17347±7482 vs.4129±2320，34418±7299 vs.6455±2606，均P＜0.05）。 结论:在腹腔注射CSE所致肺气肿小鼠中: (1)腺病毒急性感染可上调受抑的肺CD31-CD45-Sca-1+细胞; (2)腺病毒急性感染可显著激活肺组织内Shh信号通路。