背景和目的近年来我国糖尿病发病率呈现持续高速增长,现已成为全球范围内糖尿病患者人数最多的国家。众所周知,糖尿病会引发许多并发症,其中尤以动脉粥样硬化(AS)因其高致死率及高致残率受到全球医学界广泛关注。血管内皮下细胞吞噬氧化低密度脂蛋白(ox LDL)形成泡沫细胞是动脉粥样硬化发生发展过程中最为重要的起始阶段。关于泡沫细胞的最终宿命目前多认为在纤维帽下发生凋亡或者坏死形成脂质坏死核心。随着现代医学对动脉粥样硬化疾病研究不断深入,人们逐步认识单核巨噬细胞向内皮下内迁和泡沫细胞的外迁在正常生理情况下呈现动态平衡。但是在病理情况下这个过程就会被打破导致内皮下内迁的细胞增多,同时外迁细胞却越来越少,形成细胞的大量聚集,促使动脉粥样斑块形成,加速血管壁恶性重构。本研究主要借助Apo E基因敲除小鼠及RAW264.7单核-巨噬细胞建立糖尿病动脉粥样硬化模型及泡沫细胞模型。观察高脂饮食、Nε-羧甲基赖氨酸(CML)及体内注射PI3K特异性激动剂740Y-P后对小鼠动脉粥样硬化斑块影响及相关蛋白表达情况;观察CML对RAW264.7源性泡沫细胞迁移、细胞活性及相关蛋白表达的影响及PI3K/Akt信号通路在细胞迁移及细胞活性中的作用。方法本实验主要由体内试验和体外实验两个部分构成。体内实验我们采用Apo E基因敲除小鼠为研究对象,通过腹腔内注射链脲佐菌素(STZ,40mg/kg/day)制备小鼠的糖尿病模型。将血糖浓度大于300mg/d L的Apo E基因敲除小鼠分成四组如下:对照组(普通饲料)、模型组(高脂饲料)、CML组(模型组+注射CML:10mg/kg/day)、740Y-P组(CML组+注射740Y-P:5μmol/kg/day);观察各实验组小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块形成情况。采用苏木素-伊红染色(HE染色)分析Apo E基因敲除小鼠主动脉斑块组织形态学变化,油红O染色观察脂滴在小鼠斑块内的分布情况,免疫荧光、免疫组化、实时荧光定量PCR检测斑块内CD68(巨噬细胞源性细胞重要标记物)、CML表达,同时免疫荧光观察p-Akt在小鼠斑块中的表达情况及其具体位置,通过收集小鼠血清测量不同干预条件下对小鼠血脂成分变化。在细胞实验中采用RAW264.7细胞为研究对象,通过在培养基中添加ox LDL与RAW264.7细胞共孵育制备泡沫细胞模型。油红O染色定性检测泡沫细胞模型构建,酶法测定细胞内胆固醇含量变化定量检测泡沫细胞模型构建。将构建好的泡沫细胞首先给予不同浓度CML(0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L)干预,MTT、流式细胞仪检测不同浓度CML对RAW264.7源性泡沫细胞活性的影响;transwell小室检测不同浓度CML对RAW264.7源性泡沫细胞迁移的影响,以期为下一步实验挑选较为合适的干预条件。接下来实验分组如下:对照组,ox LDL组(对照组+ox LDL:40μg/ml),CML组(ox LDL组+CML:10μmol/L),740Y-P组(CML组+740Y-P:10μmol/L);transwell小室检测不同实验组RAW264.7源性泡沫细胞的迁移,western blot、细胞免疫荧光检测各实验组细胞内相关蛋白改变,鬼笔环肽标记的F-actin检测不同实验组中RAW264.7源性泡沫细胞内纤维形肌动蛋白的改变。结果(1)模型组小鼠主动脉HE染色有典型的动脉粥样斑块形成,可见明显的纤维帽。CML组的动脉粥样斑块更加明显,可见明显的纤维帽形成,出现脂质坏死核心,甚至出现纤维斑块破裂。740Y-P组小鼠主动脉斑块面积较CML组明显减少,但是较模型组斑块稍增大,可见典型斑块形成,部分纤维帽局部有破裂发生。对照组小鼠主动脉有早期斑块形成,且血管壁相对比较完整,血管内皮偶有轻微破坏,未见明显纤维帽及坏死核心。(2)免疫荧光显示模型组斑块面积较对照组增大,CML、CD68荧光亮度较对照组增强,且在动脉粥样硬化斑块部位明显增多;CML组较740Y-P组和模型组斑块面积更大,荧光强度更强(特别是斑块部位);740Y-P组斑块面积较CML组明显减小,荧光减弱;但是较模型组斑块面积稍增大,荧光强度较模型组增强,同时CML可以下调p-Akt在斑块中荧光表达,740Y-P可以部分逆转此过程,p-Akt总体荧光变化趋势和CML、CD68荧光趋势呈现反相关。与对照组和模型组相比免疫组化及RT-PCR证实CML、CD68在CML组和740Y-P组小鼠斑块内的表达呈现增多,其结果与免疫荧光强度结果类似(P<0.05)。(3)ox LDL可诱导RAW264.7细胞形成RAW264.7源性泡沫细胞。不同浓度的CML干预都可以对RAW264.7源性泡沫细胞细胞活性及增殖产生影响。且随着CML浓度的不断增加,对细胞活性的抑制作用增强。(4)CML可以抑制RAW264.7源性泡沫细胞迁移,这个过程可以部分被740Y-P所逆转。(5)CML可以明显增加RAW264.7源性泡沫细胞cleaved caspase-3蛋白表达,减低p-Akt蛋白表达,其结果可以部分被740Y-P逆转。(6)CML可以降低RAW264.7源性泡沫细胞内F-actin荧光强度,影响细胞迁移,740Y-P可以部分增强F-actin荧光强度。结论:(1)CML可以促进Apo E基因敲除小鼠主动脉粥样斑块形成,增加巨噬细胞源性细胞及脂滴在斑块内蓄积。(2)CML可以抑制RAW264.7源性泡沫细胞迁移,这个过程可以部分被740Y-P所逆转。(3)CML促进动脉粥样形成的作用可能与CML抑制巨噬细胞源性泡沫细胞迁移有关,其机制可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路。