论文部分内容阅读
目前对胃癌的治疗仍缺乏有效的手段，常规的手术、化疗、放疗或这些方法的综合治疗都尚难以达到令人满意的治疗效果，其原因复杂，影响因素众多，其中患者的免疫力低下被认为是重要的影响因素。为了增强宿主的抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤的生长，人们已经尝试了许多免疫治疗方法，但常规的免疫治疗难以奏效。近十年来，人们开始尝试多种基因治疗胃癌的方案，如自杀基因治疗、抑癌基因治疗、反义基因治疗以及免疫基因治疗等，但其临床研究进展仍十分缓慢，其主要障碍是传统的基因治疗方案采用非增殖病毒或物理化学方法，难以克服基因转染率低、表达量低及其对肿瘤细胞靶向性差，因而达不到治愈肿瘤的目的。最近，一种肿瘤细胞特异性增殖型病毒治疗方案在肿瘤治疗上取得了重要进展，它利用肿瘤细胞与正常细胞的某种差异，如P53基因突变与否，使病毒在肿瘤细胞中特异性增殖，而在正常细胞内不增殖，从而特异性杀灭肿瘤细胞。白细胞介素12是硫化物连接的二聚体，主要由特定的抗原提呈细胞产生，它的许多生物特性均与抗肿瘤免疫有关，如增强辅助T细胞效应、抗血管新生作用、释放粘附因子吸引淋巴细胞围攻肿瘤，它还可以直接增强NK细胞、LAK细胞、细胞毒性T细胞的活性，可诱导NK细胞、T细胞产生γ干扰素。为此我们设想应用这种肿瘤特异性增殖型腺病毒携带白细胞介素12基因，利用病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，而在正常细胞内不增殖的特性，从而使白细胞介素12基因在肿瘤细胞内特异性高效表达。这种结合病毒治疗与基因治疗优点的新型治疗方案称为基因病毒治疗法。它克服了传统基因治疗转染率低、表达量少及靶向性弱等缺点。为此，我们构建携带mIL-12基因增殖与非增殖型腺病毒载体，研究增殖与非增殖型腺病毒杀伤肿瘤的能力与白细胞介素12基因治疗胃癌的免疫机制，并对增殖型腺病毒对化疗药物的敏感性进行初步的研究。1．携带mIL-12基因的增殖与非增殖型腺病毒载体的构建及制备本部分研究利用基因重组技术，完成了增殖型与非增殖型腺病毒载体的构建及增殖与非增殖型腺病毒携带mIL-12基因的重组，经PCR鉴定证实目的基因插入正确，并对CNHK200-mIL-12、Ad-mIL-12进行了293细胞内扩增，经氯化铯梯度离<WP=7>心后，获得较高病毒滴度的病毒悬液，CNHK200-mIL-12、Ad-mIL-12都为1010PUF/ml，-80℃冻存待用；比较CNHK200-mIL-12、Ad-mIL-12表达mIL-12生物活性与标准品相似，无显著差异。2．携带mIL-12基因的增殖与非增殖型腺病毒对胃癌细胞的体外实验研究从本实验看，通过荧光显微镜或流式细胞仪及电镜分析，增殖型病毒可在胃癌细胞株SGC-7901内大量的增殖。增殖病毒在感染96小时后可增殖到数百倍，而非增殖型病毒在胃癌细胞内增殖很弱。腺病毒载体中mIL-12目的基因插入，未使病毒的增殖力发生变化。经Western blot 、ELISA方法证实，增殖型腺病毒携带的mIL-12基因可在胃癌SGC-7901细胞株中有较高的表达，与携带mIL-12的非增殖型病毒相比，携带mIL-12基因的增殖型腺病毒，mIL-12表达量比非增殖型病毒高出百倍。但我们也观察到，携带目的基因的增殖型腺病毒和非增殖型病毒一样，目的基因的表达有暂时性现象，随时间延长，表达量下降。CPE实验证实携带mIL-I2的增殖型腺病毒与Onyx-015一样，有对胃癌细胞的杀伤能力，对正常细胞L02杀伤力极弱。MOI为10，100，1000时，可完全杀伤培养的胃癌细胞，MOI为1时，可致胃癌细胞形态改变，MOI为0.1时，胃癌细胞变化不明显；而非增殖型腺病毒，即使MOI=500时，胃癌细胞的增殖能力也无明显的改变。 检测IL-I2抗新生血管的特性，发现携带mIL-I2的增殖及非增殖型腺病毒均有较明显的新生血管损伤作用。实验中同时也观察到增殖型腺病毒对微血管形成也有一定的影响。增殖型腺病毒抗新生血管作用可能与病毒增殖及毒性蛋白的产生有关，尚待证实。3．携带mIL-12基因的增殖型和非增殖型腺病毒治疗胃癌的体内实验研究 动物选择：动物模型选用两种不同的动物种类，615小鼠具有正常的免疫功能，可观察IL-12在体内的作用情况，但不能观察增殖型病毒在肿瘤细胞内的复制情况；缺乏胸腺的裸鼠有T细胞免疫缺陷，人肿瘤细胞可以在其体内接种生长，观察病毒的复制增殖对肿瘤的治疗作用，但不能观察免疫效应对肿瘤的作用，应用不同的动物弥补不足。判断增殖病毒在体内的增殖情况：依靠增殖病毒治疗肿瘤，判断体内病毒的复<WP=8>制情况很重要。在实验中采用两种方法，一是将携带荧光基因的增殖病毒注射入裸鼠移植肿瘤组织内，取肿瘤组织冰冻切片，观察荧光蛋白表达情况。另一种为小鼠hexon单抗免疫组化染色，可观察腺病毒表达。本实验两种方法结果均显示，增殖病毒可在小鼠移植人胃癌细胞内复制增殖，为增殖病毒临床试验提供了理论依据。 CNHK200-mIL-12、ONYX-015对于应用人的胃癌细胞株SGC-7901建立的荷瘤裸鼠有一定的治疗作用，与对照组相比，肿瘤生长明显减慢（p＜0.01）；Ad-mIL-12抑瘤作用弱。CNHK200-mIL-12、Ad-mIL-12对于615小鼠胃癌细胞株MFC建立的荷瘤615小鼠模型有较佳的治疗作用，肿瘤生长明显减慢，生存期延长（p＜0.01）；ONYX-015抑瘤?