胆管癌是最常见的一类胆道恶性肿瘤之一,近年来发病率逐年增加。胆管癌因为其特殊的解剖位置使得大多数患者在发现时已经临近晚期,丧失了根治手术的机会,因此胆管癌的手术切除率和5年生存率一直不让人满意。胆管癌对放化疗不敏感,其他一些非手术疗法也难以取得理想效果。目前仍然缺乏早期发现胆管癌的有效办法和综合治疗胆管癌的理想方案。加深对胆管癌生物学特性的了解,探寻胆管癌发生发展的内在机制,寻求有效的早期诊断和治疗方法,对于提高胆管癌的疗效,改善胆管癌患者预后具有积极意义。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor1, Tiaml)被认为是一种原癌基因,与肿瘤的侵袭转移能力密切相关。Tiam1基因通过对细胞骨架的调节作用、诱导膜皱褶、调节粘附分子的亲和力等一系列作用,发挥促进肿瘤细胞增殖和迁移的功能。Tiam1在淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌和肺癌等多种肿瘤组织及肿瘤细胞中高表达,其表达水平与肿瘤的侵袭转移能力密切相关。胆管癌最重要的生物学行为表现在顺胆管的侵袭和胆管周边组织、淋巴结及远处组织的转移。尽管Tiam1基因在多种肿瘤中的表达情况及其与各种肿瘤关系已经有学者阐述,但Tiam1基因在胆管癌的表达、功能及其机制国内外尚未见报道。因此,本研究结合临床资料分析、RNA干扰沉默基因及体内外实验等多种实验方法,从人群、分子、细胞、动物水平观察Tiam1基因在胆管癌中的作用,探讨其机制,为胆管癌的诊断和治疗提供新的基因靶点。本研究纲要：第一章：观察Tiam1基因在人胆管癌组织和良性胆管组织中的表达差异,探讨其表达水平和肿瘤分化程度、侵袭转移能力之间的关系；第二章：构建靶向干扰Tiam1基因表达的慢病毒载体,确认干扰效果后滴度测试,备下一步功能实验；第三章：使用特异性靶向干扰Tiam1基因表达的慢病毒载体作用胆管癌细胞后,观察胆管癌细胞增殖、侵袭转移能力的改变；第四章：建立稳定干扰Tiaml基因的裸鼠种植瘤模型,观察Tiam1基因沉默后裸鼠种植瘤生物学行为改变。第一章Tiam1在人胆管癌组织及细胞系中的表达及其意义目的：研究Tiam1基因在人胆管癌组织和良性胆管组织中的表达特点,分析Tiam1基因表达与肿瘤分化程度、侵袭转移能力之间的关系,观察Tiam1基因在人胆管癌细胞株的表达情况。方法：应用免疫组化法检测83例胆管癌组织和25例良性胆管组织Tiam1表达情况,收集胆管癌患者临床资料,分析Tiam1基因表达与胆管癌患者临床病理特征之间的关系,Real-time PCR检测人胆管癌细胞系QBC939和RBE中Tiam1的表达水平。结果：胆管癌组织中的Tiam1蛋白表达阳性率明显高于良性胆管组织(P<0.001),胆管癌Tiam1蛋白表达与胆管癌的分化程度、TNM分期、是否淋巴结转移相关(P<0.05),与性别、年龄、是否有远处转移无明显相关(P>0.05)。Tiam1mRNA在QBC939和RBE细胞中均有表达,在RBE细胞中的表达较高。结论：(1)Tiam1在胆管癌组织中表达明显升高,并随胆管癌恶性程度增加而升高；(2)Tiam1在RBE细胞中表达较高,选择REB细胞进行后续实验。第二章Tiam1基因RNA干扰慢病毒载体制备、包装与病毒滴度测定检测目的：筛选有效的Tiam1-siRNA序列,构建重组慢病毒Tiam1-shRNA表达载体,进行慢病毒滴度测试和包装。方法：设计针对Tiam1靶基因序列的siRNA序列,构建重组shRNA穿梭质粒,共转染293T细胞行慢病毒包装。Tiam1-shRNA慢病毒载体感染RBE细胞后观察报告基因表达情况评估转染效率,Real-time PCR检测感染的目的细胞内Tiam1基因的mRNA表达情况评估干扰效率。构建满意的慢病毒载体行滴度测试和大量包装。结果：重组质粒的DNA测序结果显示与预期DNA序列吻合,重组成功。Tiam1-shRNA慢病毒载体感染RBE细胞后观察目的细胞感染效率达到80%以上,Real-time PCR检测Tiam1基因的表达情况显示Tiam1基因表达下调超过90%。Tiam1-shRNA慢病毒载体构建成功,病毒滴度1x109TU/mL。结论：成功构建Tiam1-shRNA慢病毒载体,可有效转染RBE细胞,有效下调RBE细胞Tiam1基因表达。第三章RNAi靶向抑制Tiam1基因表达对胆管癌细胞的生物学影响目的：研究靶向抑制Tiam1的表达对人胆管癌细胞增殖、迁移活性的影响。方法：将人胆管癌RBE细胞分为三组,实验组和对照组分别转染Tiam1shRNA慢病毒载体和shRNA阴性对照慢病毒载体、空白组不做处理。Real-timePCR内源验证Tiam1基因的表达情况。细胞周期实验和MTT实验检测细胞增殖活力,Transwell实验检测细胞迁移活力。结果：Real-timePCR检测提示实验组Tiam1表达水平明显低于对照组和空白组(p<0.05),提示Tiam1shRNA对RBE细胞的Tiam1基因沉默有效。细胞周期实验提示实验组细胞周期中S期所占比例相比对照组和空白组明显降低(p<0.05),说明Tiam1基因表达下调后,细胞增殖速度受到了抑制。MTT实验结果提示实验组总体生长速度比较对照组和空白组显著降低(p<0.05),提示靶向抑制Tiam1基因表达后抑制了胆管癌细胞的增殖活力。Transwell检测结果显示,实验组转移率显著低于对照组和空白组(p<0.05),提示靶向抑制Tiam1基因表达可以明显抑制RBE细胞的迁移能力。结论：靶向沉默Tiaml的表达可以抑制胆管癌细胞的增殖与迁移活性。第四章RNAi靶向抑制Tiam1基因表达对RBE细胞生物学行为影响的裸鼠体内研究目的：研究靶向抑制Tiam1的表达对人胆管癌裸鼠皮下种植瘤生长的影响。方法：将实验裸鼠分为三组：实验组、对照组和空白组分别皮下接种Tiam1-shRNA慢病毒载体感染的RBE细胞、shRNA阴性慢病毒载体感染的RBE细胞和未被感染的RBE细胞。建立人胆管癌裸鼠皮下种植瘤模型,计算成瘤率。致瘤成功后每3天测量种植瘤的体积,绘制增长曲线。21天后处死裸鼠,获取肿瘤,称重。Real-time PCR方法检测裸鼠移植瘤中Tiaml基因的表达。结果：各组裸鼠皮下种植瘤5天后观察均成功,成瘤率100%。实验组裸鼠种植瘤生长速度明显低于对照组和空白组(P<0.05)；终点重量也显著低于对照组和空白组(P<0.05)。Real-time PCR检测结果显示实验组裸鼠移植瘤中Tiam1基因的表达明显低于对照组和空白组(P<0.05)。结论：Tiam1-shRNA’慢病毒颗粒转染的RBE细胞种植后,在裸鼠体内经过21天进展仍然能够有效沉默Tiam1基因。RNA干扰沉默Tiam1基因后可以抑制裸鼠种植瘤生长。