股骨头坏死是一种慢性进行性致残性疾病,常发生于30～60岁之间,是目前临床常见的难治性疾病。股骨头坏死的病因和发病机制多种多样,到目前为止治疗上也没有一种成熟有效的方案。股骨头坏死基本病理改变包括两个方面:(1)股骨头血液供应障碍;(2)骨实质和骨髓组织继发性坏死,股骨头塌陷,并发骨性关节炎,导致髋关节功能丧失。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有强大的体内外成骨能力,以MSCs为基础的骨组织修复已经进入临床试验阶段。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)具有很强的促血管新生和抗细胞凋亡作用。为此,我们开展了MSCs联合HGF治疗股骨头坏死的基础与临床研究,评价HGF基因修饰的MSCs(MSCs-HGF)细胞治疗的可行性,以期为相应的临床试验研究,提供必要的实验基础和依据。本研究包括四部分内容,即:(1)动物实验研究;(2)无动物源血清人骨髓MSCs培养体系的建立;(3)MSCs-HGF安全性研究;(4)临床试验初步结果。分述如下。在第一部分工作中,观察了HGF基因修饰兔MSCs治疗股骨头坏死的有效性。我们用密度梯度离心和早期贴壁分离相结合的方法,获得了形态均一的兔骨髓MSCs,且证实细胞具有体外成骨和成脂肪能力。利用外科手术法建立局部股骨头坏死模型,分别植入MSCs、MSCs-HGF或单纯生物材料,术后3个月进行病理分析和组织学评分。结果显示,单纯材料组骨缺损部位可见疏松的纤维肉芽组织,无软骨和骨带形成;MSCs组可见致密的纤维肉芽组织,其间有较多的新生血管,边沿少见类骨组织;MSCs-HGF组局部软骨样组织填充,周围可见新骨带形成。对三组进行骨移植物组织学进行评分统计,发现三组之间具有显著性差异(P<0.0001),MSCs-HGF复合材料组评分最高。上述结果提示,与MSCs比较,MSCs-HGF在该模型情况下具有更强的体内成骨能力。为探讨MSCs-HGF体内成骨优势的机制,我们利用氯化钴处理体外模拟低氧损伤,流式细胞学技术观察了处理后细胞的增殖状态。结果显示:150μM氯化钴处理72小时,MSCs组和MSCs-HGF组细胞分裂增殖比例分别为85.1±4.0%和94.5±3.1%;300μM氯化钴处理后,两组细胞分裂增殖比例分别为81.6±3.5%和94.0±2.8%(P=0.0049)。结果提示氯化钴处理明显改变了细胞增殖状态,而MSCs组和MSCs-HGF组对于氯化钴的反应是不同的,HGF基因修饰增强了MSCs的抗低氧损伤能力。已有的资料证实,人骨髓MSCs可使牛血清蛋白内在化。因此,为提高MSCs细胞治疗的实用性,在第二部分工作中,我们建立了无动物源血清人MSCs体外培养体系。利用富血小板血浆冻融裂解法制备血小板裂解物(platelet lysates, PL),并通过MTT和carboxyfluorescein diacetate succinmidyl este(rCFSE)细胞标记实验,以含10%FCS的标准培养体系为对照,观察了PL对人骨髓MSCs增殖能力的影响。结果发现1.25%浓度的PL即可获得与10%FCS相当的扩增效率。进一步的CFU-F克隆形成和原代培养生长曲线测定实验,也验证了上述结果。为探讨PL培养的细胞是否仍具有间充质干细胞的生物学特性,我们对其细胞形态学、免疫表型和体外多向分化能力等进行了检测。实验表明, PL培养的细胞呈现成纤维细胞样形态,均一表达CD29、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR,并具有体外定向成骨和成脂肪能力。为了深入探讨不同培养体系下MSCs的基因表达是否存在差异,我们采用Microarray基因芯片方法对两种培养体系MSCs所表达的细胞因子进行了比较,结果筛选到9个差异表达基因。其中,PL培养的MSCs表达上调的基因有6个:BF、BGLAP、CCL7、FST、PLAU、TNF-β;而表达下调的基因有3个:CKTSF1B1、IGFBP3、JAK2。此外,我们还发现除了培养体系外,培养时间也可以使MSCs基因表达谱发生变化。相对于10%FCS体系,1.25%PL培养体系可以促进MSCs维持BGLAP、FST的表达,并降低CKTSF1B1、JAK2的表达。上述结果均得到荧光实时定量PCR验证。差异基因筛选结果将有助于理解MSCs的趋化、迁移、增殖、分化潜能和免疫调节等生物学特性,同时也为进一步开展相关研究提供参考靶点和思路。在第三部分工作中,我们对MSCs-HGF的生物学特性和临床应用安全性进行了检定。用携带GFP的腺病毒载体(Ad-GFP)感染人骨髓MSCs,流式细胞仪对感染率进行测定,表明在感染复数MOI=150时,感染率近100%。用携带HGF基因的腺病毒载体(Ad-HGF)感染人骨髓MSCs,通过ELISA法研究不同MOI梯度对HGF表达量的影响,以及Ad-HGF感染MSCs后HGF表达的时间变化规律,发现以150 MOI感染复数感染MSCs后48小时,表达量最高,约为147±18ng/ml。上述结果证实,Ad-HGF可以有效地转染MSCs,并能短期、高效表达HGF。进一步的细胞形态学、免疫表型、体外分化能力分析发现,HGF基因修饰不改变MSCs细胞表型,不影响MSCs分化潜能。有意义的是,在持续性低氧(3%O2)条件下,Ad-GFP和Ad-HGF感染后24～48h,MSCs-HGF和MSCs-GFP的增殖速度无明显差异;而在感染后48h之后,MSCs-HGF显示了比MSCs-GFP更高的增殖能力(P=0.0095)。这一结果与HGF的表达时间规律有一致性,说明HGF可维持持续低氧环境下MSCs细胞的增殖。着眼于临床应用,我们进一步评价了MSCs-HGF的安全性问题。细胞在连续传代11次后,应用G显带染色体核型分析显示未见染色体畸变及数目异常,证明了MSCs在连续传代扩增过程中的遗传稳定性。经软琼脂集落形成和裸鼠体内接种实验表明MSCs-HGF无永生化能力和体内致瘤性。BALB/c小鼠注射MSCs-HGF 1.0×107,平均4.0×105细胞/g体重,超过人体常规用量的400倍。注射后未发现细胞输注小鼠出现任何不良反应,体重无明显改变,病理分析各主要脏器形态结构正常。上述结果提示,利用PL培养体系所获得的MSCs-HGF细胞制剂,基本符合国家FDA建议的《人体细胞与基因治疗规范要点》标准。在上述实验的基础上,我们尝试了MSCs-HGF治疗激素性股骨头坏死的探索性临床研究。抽取患者肝素化骨髓,进行MSCs培养、Ad-HGF感染及MSCs-HGF制备,并将细胞注入局部囊性坏死区。随访发现,MSCs-HGF治疗9个月后,CT扫描显示出现重建性骨修复,低密度区范围缩小,密度增高,骨小梁和新骨生成,Harris评分提高。该探索性病例的临床研究,为MSCs-HGF治疗股骨头坏死的规范应用,提供了有益的支持。通过以上较系统的研究,我们认为:(1)HGF基因修饰的MSCs能有效治疗兔股骨头坏死,其作用机理可能与HGF促血管新生以及增强MSCs抗低氧损伤能力有关。(2)建立了无动物源血清人MSCs体外培养体系,培养所获得细胞具有间充质干细胞生物学特性。(3)经Microarray和荧光定量PCR证实,与FCS体系比较,PL体系培养的MSCs极少数细胞因子表达水平发生了改变,这种差异的具体原因有待探讨。(4)Ad-HGF可以高效感染MSCs,并且不改变其表型特征和功能特性,但细胞抗低氧损伤能力增加。(5)体外实验证实了MSCs-HGF的安全性,初步临床结果为其应用提供了有益的参考。