目的探讨呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)非结构蛋白NS2在RSV感染人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)过程中转录水平的变化情况,研究NS2在RSV感染A549细胞活化TLR7中的作用机理,信号转导等,为防治呼吸道合胞病毒感染提供新的思路。方法以RSV感染体外培养的A549细胞,设立正常对照组、RSV感染组、RSV NS2小干扰RNA(NS2 si RNA)沉默组及TLR7激动剂(Resiquimod,R848)组。各组分别于病毒感染后的4h、12h、24h、48h收集细胞和培养上清液。(1)实时荧光定量PCR法(real-time PCR)检测各组不同时间点RSV NS2,TLR7 m RNA表达量变化;(2)免疫印迹法(Western-blot)检测各组不同时间点IFN-βToll样受体相关区域连结蛋白(TIR domain-containing adapter inducing interferon IFN-β,TRIF),肿瘤坏死因子相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)及磷酸化NF-κB/P65抑制蛋白(Phosphorylated inhibitor of nuclear factor kappa B kinase,p-IκB-α)蛋白水平的表达变化;(3)酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中INF-α,INF-β含量的变化。结果(1)Real-time PCR结果显示:RSV感染后TLR7 m RNA表达上升,在感染的48h达到了正常对照组的8倍,差异有统计学意义(P<0.01);在R848+RSV组,TLR7 m RNA表达量显著升高,在感染的48h达到了正常对照组的17.3倍,与RSV感染组相比,TLR7 m RNA表达量升高,感染24h表达量为RSV感染组的1.2倍,具有统计学意义(P<0.01);在NS2 si RNA+RSV组,TLR7 m RNA表达量较正常对照组显著上升,但较RSV感染组下降,感染的48h表达量为RSV感染组的70%,差异从12h开始具有统计学意义(P<0.05)。RSV感染后NS2 m RNA表达上升,在R848+RSV组,NS2 m RNA表达量具有感染时间依赖性,与RSV感染组相比,NS2 m RNA表达量升高,感染24h时表达量为RSV感染组的1.1倍,差异无统计学意义(P>0.01)。在NS2 si RNA+RSV组,NS2 m RNA表达量较RSV感染组下降,且从感染12h开始显著下降,感染的24h仅为RSV感染组的38%,48h为39%,差异具有统计学意义(12h,P<0.05;24h、48h,P<0.01)。结果表明RSV感染能够上调TLR7 m RNA的表达,在RSV感染A549细胞活化TLR7过程中,NS2发挥一定的促进作用。(2)Western-Blot结果显示:正常对照组中,TRIF、TRAF6和p-IκB-α蛋白的表达量较低,经RSV感染之后,随感染时间增加,表达量增加,升高有显著性差异(P<0.01);在R848+RSV组,TRIF、TRAF6和p-IκB-α蛋白表达量较RSV感染组增加,差异有统计学意义(P<0.05);在NS2 si RNA+RSV组,TRIF、TRAF6和p-IκB-α蛋白表达量较正常对照组上调,但相对于RSV感染组,表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明RSV NS2可以活化TRIF,TRAF6及p-IκB-α蛋白的表达。(3)ELISA法结果显示:与正常组细胞培养上清相比,RSV感染组IFN-α,IFN-β含量升高,从4h开始升高有统计学意义(P<0.01),随着感染时间的延长而增加;在R848+RSV组,IFN-α,IFN-β含量亦随感染时间的延长逐渐增加,感染4h升高有统计学意义(P<0.05);在NS2 si RNA沉默组,IFN-α,IFN-β含量随感染时间量逐渐增加,与RSV感染组相比,有所升高,且从感染4h开始,差异有显著性(P<0.01),说明在病毒感染过程中,NS2抑制了IFN-α,IFN-β的表达。结论NS2在RSV感染A549细胞活化TLR7过程中起到一定的促进作用,活化TRAF6、TRIF、p-IκB-α表达,导致下游I型干扰素IFN-α,IFN-β表达量下降。